崔濤 鄭秀娥 楊陽 郭金雙 王玉 夏文龍 陳洪忠 山東省食品藥品審評查驗中心 （山東 濟南 250014）

內(nèi)容提要：心型脂肪酸結(jié)合蛋白測定試劑是用于體外定量測定人體樣本中心型脂肪酸結(jié)合蛋白含量的試劑，臨床上主要用于急性心肌梗死輔助診斷。已上市產(chǎn)品以采用免疫比濁法、化學發(fā)光法、熒光免疫層析法的產(chǎn)品為主。文章對產(chǎn)品在注冊技術(shù)審評過程中的要點進行分析，旨在對注冊申請人在產(chǎn)品的研發(fā)和注冊過程中提供參考與幫助。

心型脂肪酸結(jié)合蛋白（Heart-Type Fatty Acid-Binding Protein，h-FABP）是心臟中的一種小胞質(zhì)蛋白，分子量約為15kDa，是心臟最豐富的蛋白質(zhì)之一，約占心肌細胞可溶性蛋白總量4%～8%。心肌缺血性損傷出現(xiàn)后，h-FABP可以早在胸痛發(fā)作后1～3h在血液中被檢測出，6～8h達到峰值，然后在12～24h內(nèi)恢復正常，在早期急性心肌梗死診斷中具有較高的敏感性和良好的特異性。與心肌肌鈣蛋白、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶等指標聯(lián)合檢測，可以提高急性心肌梗死的診斷率，對臨床治療方案的制定以及治療藥物的選擇等提供指導性信息[1-4]。

目前，臨床檢測h-FABP的常用方法包括免疫比濁法、化學發(fā)光法、熒光免疫層析法等，根據(jù)對已上市產(chǎn)品的數(shù)量統(tǒng)計，采用以上三種方法學的產(chǎn)品比例大約各占三分之一，三種方法學產(chǎn)品有各自的優(yōu)缺點，可以滿足不同等級醫(yī)療機構(gòu)、不同應用環(huán)境下的臨床使用要求。

1.適用范圍及管理類別

本文所指h-FABP測定試劑是用于體外定量測定人體血液樣本（血清、血漿或全血）中h-FABP含量的試劑。據(jù)有關(guān)文獻報道，心肌損傷后尿液中也存在h-FABP，本文不對此種情況進行討論。該產(chǎn)品從大類上講是屬于一種蛋白質(zhì)測定的試劑，管理類別為Ⅱ類，境內(nèi)注冊人應向各省、自治區(qū)、直轄市藥品監(jiān)督管理部門申報該產(chǎn)品，境外注冊人應向國家藥品監(jiān)督管理局申報該產(chǎn)品，提交相應注冊申請資料。

2.分析性能研究

注冊申請人應當在原材料和生產(chǎn)工藝經(jīng)過選擇和確認、質(zhì)量管理體系得到有效控制并且保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的基礎上，進行產(chǎn)品的分析性能評估。

用于分析性能評估的樣本，應盡量與預期適用的真實臨床樣本一致，參考品或質(zhì)控品不適合作為樣本用于分析性能評估。

不同方法學的產(chǎn)品還應根據(jù)方法學特點制訂不同的性能指標進行分析性能評估：如免疫比濁法產(chǎn)品應制訂空白吸光度、靈敏度等指標，熒光免疫層析產(chǎn)品應制訂膜條寬度、液體移行速度等指標。

2.1 校準品

校準品是產(chǎn)品的重要組成部分，用于定量檢測時對檢測項目的校準。校準品量值溯源文件中應明確校準品的溯源鏈信息，說明溯源鏈頂端所用的參考測量程序，傳遞至下一級時所符合的標準，不確定度的影響因素和計算方法。參考YY/T 1549《生化分析儀用校準物》等的要求，制訂相應的技術(shù)指標，同時校準品應盡可能采用血清基質(zhì)，以避免可能存在的基質(zhì)效應的影響。

2.2 準確度

準確度反映的是測定結(jié)果與真值的接近程度，評價方法主要包括參考物質(zhì)檢測、回收試驗、比對試驗等。參考物質(zhì)檢測是優(yōu)先推薦的方法，一般以相對偏差來表示，目前該產(chǎn)品無相應國家標準品發(fā)布，如有，則優(yōu)先采用國家標準品進行準確度研究。參考物質(zhì)一般包括具有互換性的有證參考物質(zhì)、公認的參考品、標準品等。當采用回收實驗時，應由具有一定溯源性的待測物配制標準溶液，建議標準溶液的體積和人源性樣品體積比不超過1:9，盡量減小對檢測樣本基質(zhì)的影響。當采用方法學比對的方法進行準確度評價時，應采用參考測量程序或臨床應用廣泛、質(zhì)量得到普遍認可的已上市同類試劑進行比對，如條件允許，建議與具有相同溯源性的分析系統(tǒng)作比對。樣本盡可能使用新鮮樣本。

2.3 精密度

精密度反映的是多次測定結(jié)果之間接近的程度，主要受隨機測量誤差大小的影響，精密度包括重復性、中間精密度和再現(xiàn)性。重復性一般是指在同樣的操作條件（環(huán)境、測量系統(tǒng)、產(chǎn)品批次等）下，由同一操作者測定所得結(jié)果的精密度，體現(xiàn)的是室內(nèi)精密度。中間精密度是指在同一檢驗實驗室，時間、操作者、儀器設備變化的條件下測定結(jié)果的精密度。再現(xiàn)性則指的是在不同檢驗實驗室、不同操作者條件下測定結(jié)果的精密度，體現(xiàn)的是室間精密度。精密度研究時應充分考慮的條件包括：操作者、測量儀器、試劑批次（lot）、校準（校準品批次，校準周期）、時間、地點、環(huán)境條件等。

2.4 檢測限

檢測限通常包括空白限（LoB）、檢出限（LoD）以及定量限（LoQ）等指標，對于h-FABP來講，其參考區(qū)間為＜5～7ng/mL。檢測值過小并沒有實際的臨床意義，因此應至少進行定量限指標的建立和驗證，選擇多個樣本，在多天內(nèi)進行研究進行合理評估和驗證。定量限應考慮偏倚和精密度的要求，滿足預設準確度指標。

2.5 線性區(qū)間

線性區(qū)間的下限不應為零，可采用臨床中高濃度和低濃度樣本配制一系列不同濃度的樣本，進行線性區(qū)間的研究和驗證，檢驗方法中應明確具體的配制濃度個數(shù)，濃度盡量涵蓋線性區(qū)間上限和下限。同時，線性區(qū)間的確定還應結(jié)合產(chǎn)品原材料、生產(chǎn)工藝等多因素，如產(chǎn)品線性區(qū)間上限濃度低于臨床異常高值上限，則應進行樣本多倍稀釋研究。保證產(chǎn)品能滿足臨床檢測的需要。

2.6 特異性

特異性主要包括交叉反應和干擾物質(zhì)。到目前為止，已證實有多種不同的組織特異分布的脂肪酸結(jié)合蛋白，注冊申請人應對不同類型的脂肪酸結(jié)合蛋白可能存在的交叉反應進行分析驗證。干擾物質(zhì)研究應當考慮常見的內(nèi)源性干擾、外源性干擾和已有報道的干擾物質(zhì)。對甘油三酯、膽紅素、血紅蛋白、類風濕因子等干擾物的研究過程中應考慮這些物質(zhì)在血液樣本中的正常值和異常值含量，研究結(jié)果應在說明書中進行描述。

2.7 鉤狀效應

免疫方法的產(chǎn)品易出現(xiàn)“高劑量鉤狀效應”，即在高濃度時，待測物濃度與檢測信號值呈現(xiàn)出與校準曲線相反的數(shù)量關(guān)系。在適用情況下（如雙位點或夾心免疫測定法），應將線性范圍研究擴展到可報告范圍之外，達到在臨床條件下存在的最高濃度，以評估該試劑是否存在高劑量鉤狀效應并提交研究資料。鉤狀效應研究時，一般采用高濃度的樣本進行梯度稀釋后由低濃度至高濃度逐步測定的方法，因此，在鉤狀效應研究之前應先進行樣本稀釋倍數(shù)的研究，避免樣本稀釋本身的影響。注冊申請人應依據(jù)產(chǎn)品的反應原理和操作過程選擇是否需要此項研究。

3.穩(wěn)定性研究

產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究主要包括實時穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性3部分，內(nèi)容包含研究方案、報告和數(shù)據(jù)等。

實時穩(wěn)定性也可稱為貨架有效期，主要考察產(chǎn)品在實際儲存條件下的保存期限，研究資料中應明確所用的產(chǎn)品批次，所用產(chǎn)品批次數(shù)量不少于3批。明確儲存環(huán)境（如溫度、濕度和光照等）、所進行檢驗的時間間隔等。檢驗的間隔時間應合理，如產(chǎn)品的有效期預設定為1年，則可每隔3～4個月進行一次檢測，考察產(chǎn)品檢驗結(jié)果是否仍符合產(chǎn)品技術(shù)要求中性能指標的規(guī)定，當產(chǎn)品達到預設定的有效期時，可繼續(xù)對產(chǎn)品進行1～2個月的檢測研究。

使用穩(wěn)定性是對產(chǎn)品開封后使用過程的考察，一般稱為開封（瓶）穩(wěn)定性。如產(chǎn)品以凍干粉形式提供，則需要進行復溶穩(wěn)定性研究。如產(chǎn)品保存條件為冷凍且可多次使用，則需要凍融次數(shù)的研究。包含校準品、質(zhì)控品的，還應提交校準、質(zhì)控頻率或校準、質(zhì)控穩(wěn)定性研究資料。

運輸穩(wěn)定性是考察產(chǎn)品在預期的運輸條件下對產(chǎn)品產(chǎn)生的影響，運輸過程應在產(chǎn)品規(guī)定的儲存條件（如溫度、濕度、光照等）下進行，同時考慮產(chǎn)品的包裝方式，防護措施，運輸?shù)淖畈顥l件（運輸時間、環(huán)境溫度、震動等）。運輸穩(wěn)定性研究資料中應詳細描述運輸時間、運輸方式、產(chǎn)品批次等信息。運輸穩(wěn)定性研究應結(jié)合到實時穩(wěn)定性研究中，將進行實時穩(wěn)定性研究的產(chǎn)品先進行運輸穩(wěn)定性的考察，運輸后的產(chǎn)品按時間間隔進行實時穩(wěn)定性的研究。如產(chǎn)品包含多種型號規(guī)格，應注意選取代表性包裝規(guī)格進行研究。

4.參考區(qū)間

h-FABP是一項較為常規(guī)的檢測項目，應優(yōu)先選擇臨床檢驗中心、專家共識等來源的臨床已普遍認可的參考區(qū)間作為標準，采取驗證的方法進行參考區(qū)間的確認，這樣既能保證檢驗結(jié)果的權(quán)威性，也有利于檢驗實驗室之間檢驗結(jié)果的互認[5]。對本檢測項目來講，只有參考上限具有臨床意義。本部分資料需提供樣本來源、詳細的試驗數(shù)據(jù)、所用的統(tǒng)計方法等。樣本來源中應明確參考人群的納入標準，盡量不要選擇住院或者門診患者。樣本例數(shù)的確定應符合設定的置信區(qū)間的要求，至少120例樣本可以保證能正確的估計參考區(qū)間的90%置信區(qū)間，至少198例樣本可以保證評估99%置信區(qū)間，同時還要考慮到若有離群值，需要在離群值剔除后樣本例數(shù)仍能滿足統(tǒng)計需要。

5.臨床評價資料

體外診斷試劑產(chǎn)品的臨床評價途徑包括臨床評價和臨床試驗兩種[6]，h-FABP測定試劑反應原理、預期用途明確、工藝成熟，屬于《免于臨床試驗體外診斷試劑目錄》中產(chǎn)品?？赏ㄟ^同品種方法學比對的方式證明產(chǎn)品的安全性、有效性。如產(chǎn)品應用范圍涉及消費者自測、家用，或申請人自身對產(chǎn)品臨床資料有相應要求，也可通過臨床試驗的方式進行臨床評價，試驗參考《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》，試驗過程遵守《醫(yī)療器械臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》的要求。臨床評價過程中應注意以下幾點。

5.1 研究方法的選擇

h-FABP檢測已在臨床中得到了廣泛的應用，上市產(chǎn)品超過百家，各類方法學齊全，采用同品種方法學比對研究是最為經(jīng)濟、合理的研究方法。選擇對比試劑時，應盡量選擇方法學相同，線性范圍、準確性等性能接近的產(chǎn)品作為對比試劑。如注冊人認為所申報產(chǎn)品優(yōu)于同方法學已上市產(chǎn)品，也可采用性能指標接近的不同方法學產(chǎn)品作為對比試劑，如熒光免疫層析類產(chǎn)品也可選用采用化學發(fā)光方法學的產(chǎn)品作為對比試劑。

5.2 樣本要求

臨床評價所選擇的樣本應至少包含樣本來源、樣本類型、樣本保存狀態(tài)、可追溯的編號、臨床診斷信息（參考區(qū)間外濃度樣本患者）等，總樣本數(shù)量一般不少于100例，樣本應包含一定數(shù)量涵蓋干擾因素的樣本，同時能夠覆蓋具有臨床意義的待測物質(zhì)濃度范圍。樣本選擇時還應考慮到年齡、性別的差異，盡量覆蓋各類適用人群。

5.3 檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

檢測數(shù)據(jù)收集后，應首先繪制散點圖和差異圖，散點圖和差異圖可以直觀地觀察數(shù)據(jù)是否覆蓋了具有臨床意義的待測物質(zhì)濃度范圍，數(shù)據(jù)在待測物質(zhì)濃度范圍內(nèi)均勻分布情況以及是否存在離群值等，離群值的個數(shù)一般不得超過限值（2.5%）。同時根據(jù)散點圖和差異圖判斷數(shù)據(jù)滿足的假設前提，確定合適的回歸分析方法和對待評價試劑與對比試劑偏倚的評價。常見的回歸分析方法包括Deming回歸、Passing-Bablok回歸分析和最小二乘回歸等。偏倚的評價則一般將醫(yī)學決定水平處的預期偏倚及其95%可信區(qū)間與待評價試劑的可接受偏倚的限值進行比較。

6.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

產(chǎn)品技術(shù)要求格式應符合《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導原則》（國家藥品監(jiān)督管理局通告2022年第8號）的要求，其具體內(nèi)容包含產(chǎn)品性能指標和檢驗方法兩部分。

6.1 適用的產(chǎn)品標準

h-FABP目前無強制性國家標準，可引用的推薦標準為YY/T 1590《心型脂肪酸結(jié)合蛋白測定試劑盒（免疫比濁法）》。對于免疫比濁法原理的產(chǎn)品，鼓勵申請人采用推薦性標準。其他方法學產(chǎn)品，也可參考其中部分性能指標。

6.2 主要性能指標

性能指標應在滿足臨床應用的基礎上根據(jù)產(chǎn)品的特點、研究結(jié)果來制定，該產(chǎn)品作為定量測定試劑，主要性能指標包括準確度、精密性和線性區(qū)間等，根據(jù)產(chǎn)品方法學的不同還有裝量、空白吸光度、靈敏度、膜條寬度等。同一性能指標，根據(jù)其在產(chǎn)品中的作用不同，要求也有不同，比如裝量指標，一般情況下可用裝量不少于某體積表示，但對于樣本緩沖（處理）液來講，裝量過多或過少都會影響檢測結(jié)果的準確性，則裝量用某體積±5%類似的形式更為合理。6.3檢驗方法

產(chǎn)品的檢驗方法應與性能指標相匹配，如裝量為毫升級別，可用量筒進行測量，如裝量＜1mL，可采用微量加樣器輔助進行測量。檢驗方法應明確、具體，具有可操作性。如檢測次數(shù)應描述為重復測量具體的次數(shù)，而不應該描述為不低于多少次。

6.4 產(chǎn)品檢驗報告

在保證產(chǎn)品原材料和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定可靠的基礎上，采用在符合醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系相關(guān)要求的條件下生產(chǎn)的產(chǎn)品進行檢驗。可提交以下任一形式的檢驗報告：①注冊申請人出具的自檢報告。②委托有資質(zhì)的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)出具的檢驗報告。

如注冊申請人提交自檢報告，還需按照《醫(yī)療器械注冊自檢管理規(guī)定》的要求提交相應資料。質(zhì)量管理體系核查時會對企業(yè)的自檢能力進行相應檢查。

7.產(chǎn)品說明書

說明書是體外診斷試劑注冊申報資料的重要組成部分，將作為醫(yī)療器械注冊證的附件予以審批?？梢灾笇R床檢驗人員正確操作、使用產(chǎn)品，保證檢驗過程的規(guī)范性，確保實驗結(jié)果的準確性。說明書中所包含數(shù)據(jù)的信息，如樣本要求、產(chǎn)品有效期、參考區(qū)間、性能指標、干擾信息等均應在申報資料中有相應的支持性研究資料。同時應注意以下幾點：①非試劑組分，試劑盒中不包含但對檢驗必需的試劑組分，應在主要組成成分部分注明相關(guān)信息。②如產(chǎn)品包含運輸穩(wěn)定性信息，則運輸穩(wěn)定性的溫度要求不能超出產(chǎn)品的保存條件的規(guī)定。③如有血漿樣本，應注明可使用的抗凝劑種類，尤其是采用枸櫞酸鈉為抗凝劑時，應說明抗凝劑體積對樣本測定結(jié)果的影響。④如樣本類型包括全血樣本，應說明紅細胞壓積對檢測結(jié)果的影響或相應要求。⑤明確超出測定范圍的檢測結(jié)果的報告方式。⑥樣本是否可以稀釋后測定，如需稀釋，應注明稀釋最大稀釋比例。

8.小結(jié)

本文基于現(xiàn)行法規(guī)和注冊申報資料的要求，總結(jié)分析了h-FABP測定試劑注冊申報中相關(guān)技術(shù)文件的審評要點。對分析性能研究、穩(wěn)定性研究、參考區(qū)間、臨床評價、產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告、產(chǎn)品說明書等方面作一概述[7]，希望能夠為注冊人在h-FABP測定試劑產(chǎn)品的研發(fā)和注冊過程中提供一定的參考和幫助，助力產(chǎn)品順利完成注冊。