陳見友 蘇 偉 劉曉雁 張高磊

首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院皮膚科，北京,100020

先天性色素痣(congenital melanocytic nevi，CMN)是由來源于神經(jīng)嵴的黑素細胞良性增生而形成，在出生時或生后數(shù)周內(nèi)即可發(fā)現(xiàn)。CMN的分類在過去只是單純根據(jù)大小來進行的。近年來，專家共識建議根據(jù)預(yù)計成人大小(predicted adult size，PAS)、伴隨痣數(shù)量和數(shù)個形態(tài)描述性指標來進行分類。小型CMN是指PAS<1.5 cm，中型CMN是指1.5 cm≥PAS<20 cm(M1:1.5～10 cm,M2: >10～20 cm)，大型CMN是指20 cm≥PAS<40 cm(L1: >20～30 cm, L2:>30～40 cm)，而巨型CMN是指PAS≥40 cm(G1: >40～60 cm, G2: >60 cm)[1]。

CMN通常是良性的黑素細胞腫瘤，主要存在NRAS 或BRAF兩種體細胞突變。既往國外文獻報道顯示，中小型CMN更容易出現(xiàn)BRAF V600E突變，而大/巨型CMN則更容易出現(xiàn)NRAS(Q61K)突變[2-4]。超過80%的黑素細胞痣含有BRAF突變[5],而BRAF(V600E)突變是黑素瘤中最常見的驅(qū)動因子，在RAS/絲裂原活化蛋白激酶通路(MAPK)中編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶[6-7]。

伴有BRAF(V600E)突變的黑素瘤具有某些組織病理學特征，包括表皮內(nèi)散在黑素細胞、表皮內(nèi)黑素細胞巢狀形成、表皮增厚和較大的痣細胞[8]。然而，伴有BRAF(V600E)基因突變的CMN的增殖活性和組織病理學特點尚無相關(guān)報道。

本研究中，我們的主要目標是確定BRAF(V600E)基因突變對CMN的增殖活性和組織病理學特征的影響。

1 對象與方法

1.1 對象 本研究經(jīng)首都兒科研究所倫理審查委員會批準(SHERLL2020054)并根據(jù)《赫爾辛基宣言》進行的。2018年12月至2020年12月, 在首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院皮膚科門診收集了185例CMN 患者。入選標準為：生后既有或者生后1個月內(nèi)發(fā)現(xiàn)的色素痣。排除標準：藍痣、spitz 痣、出生1個月后才發(fā)現(xiàn)的色素痣或發(fā)病時間不詳?shù)纳仞?。入組前，每位患者由監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本組織的處理 185例CMN全部手術(shù)切除并將標本分成兩部分, 其中一部分放在福爾馬林里固定并進行HE染色，然后根據(jù)Marchetti等提出的方法進行評估[4]；第二部分：將多余的皮損及脂肪組織去除后迅速置于-80℃冰箱保存。根據(jù)既往文獻報道的方法進行DNA提取[3]，根據(jù)制造商的操作說明使用QIAamp DNA 迷你試劑盒Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)。我們進行了BRAF和NRAS基因突變檢測。其中，發(fā)現(xiàn)24例CMN具有BRAF(V600E)突變，并作為突變組，從其余患者中隨機選取24例沒有BRAF V600E突變的CMN作為對照組，根據(jù)患者的性別、年齡、痣的大小和解剖部位進行嚴格匹配。

1.2.2 組織病理學分析 一共獲得了48個HE染色的切片。對HE染色的切片進行組織病理學分析，并量化以下參數(shù):(1)組織病理學分類(交界痣, 復(fù)合痣或皮內(nèi)痣)；(2)主要顯微解剖生長模式；(3)交界部位黑素細胞巢的數(shù)量；(4)黑素細胞浸潤的深度:①表皮內(nèi)；②真皮淺層(1分)；③真皮中層(2分)；④真皮深層(3分)；⑤皮下脂肪層(4分)；(5)結(jié)構(gòu)特征和細胞異型性。顯微解剖生長模式量化為:①表皮內(nèi)為主；②表皮部分和真皮部分幾乎相等；③主要在真皮。任何結(jié)構(gòu)紊亂和/或細胞異型性的存在被視為陰性或陽性。

1.2.3 免疫組化方法評價CMN的增殖活性 一共獲得了48例CMN的石蠟塊。進行Ki67的免疫組化檢測。該抗體為小鼠抗人單克隆抗體(Clone OTI8H5, ZSBG-Bio, CHINA)。在400倍顯微鏡放大視野下計數(shù)ki67陽性痣細胞數(shù)(每視野實際覆蓋面積0.11 mm2)。ki67陽性痣細胞可在真皮-表皮交界處形成巢，能夠與表皮角質(zhì)形成細胞區(qū)分。隨機選取10個高倍視野記錄陽性痣細胞數(shù)。用平均陽性痣細胞數(shù)表示Ki67指數(shù)，并評價陽性細胞的位置和分布規(guī)律。

在5 μm厚的福爾馬林固定石蠟包埋組織切片上進行免疫組化研究。在相同條件下，所有切片均采用免疫組化pv-9000兩步法進行Ki67蛋白染色。切片常規(guī)脫蠟水合，高壓修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻滯劑。室溫孵育10 min，蒸餾水洗凈，PBS泡5 min, 3次。加入Ki67一抗(克隆OTI8H5, ZSBG-Bio，中國1∶100稀釋)，37℃孵育1 h。用PBS浸泡洗滌2次，每次5 min。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS v.22進行統(tǒng)計分析。根據(jù)BRAFV600E基因突變狀態(tài)進行分層描述性統(tǒng)計，連續(xù)變量采用均值和標準差(SD)。采用配對t檢驗比較連續(xù)資料的均數(shù)。對二分類變量的組織病理學特征與Ki67指數(shù)進行相關(guān)及偏相關(guān)系數(shù)的顯著性檢驗。所有給定的P值都是雙尾性的，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 CMN(n=48, 共24對)數(shù)據(jù)見表1。突變組和對照組的CMN特征。突變組和對照組在性別、年齡、痣大小和解剖部位上都是嚴格匹配的。兩組間在年齡、性別、黑素瘤史和非黑素瘤皮膚癌史上沒有統(tǒng)計學差異。

表1 突變組和對照組CMN的特點

2.2 組織病理學特點 本研究中一共46例復(fù)合痣(46/48, 95.8%)。 其中, 突變組僅有2例皮內(nèi)痣(4.2%), 而對照組中有5例皮內(nèi)痣(10.4%)。所有的CMN均具有先天性生長模式，而且隨著真皮深度的增加，痣細胞巢和痣細胞的尺寸逐漸減小。痣細胞向真皮深層網(wǎng)狀延伸，甚至皮下脂肪層。累及網(wǎng)狀真皮層時，痣細胞在膠原束之間排列成行、索條狀和片狀。累及皮下脂肪層時，痣細胞常常沿皮下脂肪纖維間隔延伸，有時可浸潤脂肪小葉(圖 1)。痣細胞也可以累及毛囊上皮、皮脂腺、汗腺管、血管壁和立毛肌等部位。本研究中偶見有絲分裂象，其中突變組發(fā)現(xiàn)3例，對照組中2例，另外，對照組2例表皮內(nèi)痣細胞呈paget細胞樣改變。突變組與對照組在痣細胞累及深度、痣細胞巢個數(shù)、細胞巢大小等方面的差異均有統(tǒng)計學意義，其P值分別為0.017, 0.008 和0.015(表2)。

圖1 1a:先天性生長模式，累及附屬器上皮組織，包裹在血管周圍，分布在膠原束間;伴有BRAF(V600E)基因突變的CMN比1b累及更深層次的皮膚組織 (1a、1b：HE,×40) 圖2 Ki67染色局限于陽性細胞的細胞核，呈明顯的顆粒狀染色，不均勻(免疫組化，×100) 圖3 細胞核染色呈棕色表明Ki67陽性表達(免疫組化,×400) 圖4 BRAF c.1799T>A的突變 圖5 NRAS c.181C>A的突變 圖6 Ki-67和痣細胞巢個數(shù)之間的相關(guān)性 圖7 Ki-67和痣細胞巢個數(shù)之間的相關(guān)性

表2 突變組和對照組CMN的統(tǒng)計學特征

2.3 免疫組化特點 Ki67染色僅限于陽性細胞的細胞核，呈不均勻的顆粒狀染色，偶爾核仁區(qū)染色明顯。未見細胞質(zhì)染色。真皮-表皮交界處染色更為常見(圖 2、3)。突變組平均Ki67個數(shù)為4.4，而對照組為3.2，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.034)(表2)。

2.4 基因突變情況 本研究通過一代測序方法進行基因檢測。185例患者中，24例(13%)出現(xiàn)BRAF(V600E)基因突變，11號外顯子c.1799T>A突變，導(dǎo)致第600位纈氨酸變?yōu)楣劝彼?p.VF600E)(見圖4)；8例出現(xiàn)NRAS(Q61K)基因突變，2號外顯子c.181C>A突變,導(dǎo)致第61號氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)橘嚢彼?p. Q61K)(圖5)。

2.5 相關(guān)性分析 本研究發(fā)現(xiàn)，痣細胞巢的數(shù)量和Ki67之間、Ki67和痣細胞深度、痣細胞巢大小和痣細胞巢數(shù)量、痣細胞巢數(shù)量和痣細胞深度之間具有較強的相關(guān)性(線性回歸分析，Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.58、0.43、0.33和0.4;P值分別為0.015、0.002、0.02和0.005)(圖6、7)。

3 討論

目前關(guān)于基因突變對CMN的病理和增殖活性影響的文獻報道較少[5，9]。 這些報道是總體性研究，沒有區(qū)分色素痣是先天性的還是后天性的。據(jù)我們所知，本研究首次證實了BRAF V600E突變與先天性黑素細胞痣增殖活性和組織病理學之間的關(guān)系。

根據(jù)組織病理學特點，CMN可以分為交界痣、復(fù)合痣和皮內(nèi)痣。組織學特征主要與痣的大小有關(guān)[1]。本研究中幾乎所有的痣都屬于復(fù)合痣(46/48, 95.8%)，組織病理學特征與CMN模式是一致的,如結(jié)構(gòu)對稱、邊界清晰,痣細胞巢比較一致并均等的分布在表皮內(nèi)，真皮內(nèi)的痣細胞巢和痣細胞隨著深度的增加而逐漸成熟, 痣細胞包裹在血管和附屬器周圍或散在膠原束之間[10]。兩個匹配組的痣深度差異是顯著的。BRAF(V600E)突變組的痣細胞比非突變組延伸更深。這種現(xiàn)象可能是由于BRAF V600E基因突變后痣細胞增殖活性增強所致。我們可以初步得出痣浸潤深度不僅與痣大小有關(guān)，還與CMN中BRAF(V600E)基因突變有明顯相關(guān)性。 此外，本研究的結(jié)果擴大了對CMN基因型-表型相關(guān)性的認識。

Ki67單克隆抗體已廣泛應(yīng)用于組織病理學，并在許多人類惡性腫瘤的分級中具有特殊價值，并與患者生存情況相關(guān)[11]。關(guān)于細胞增殖活性標記物Ki67在CMN中的表達的數(shù)據(jù)有限。Soyer在他的研究中納入了色素痣，并發(fā)現(xiàn)Ki67抗原表達在痣、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤之間存在顯著差異[12]。CMN是一種良性皮膚腫瘤，增殖指數(shù)一般不太高，本研究中的最大值是11。BRAF(V600E)突變的CMN的增殖活性與對照組相比差異有顯著性。伴有BRAF(V600E)突變的CMN具有更高的增殖活性，一方面能夠促進CMN持續(xù)性增生擴大，另一方面，在受到其他刺激因素的作用下，如陽光照射、輻射和摩擦，更容易發(fā)展成惡性黑素瘤。

BRAF(V600E)基因突變不僅在色素痣中出現(xiàn)的頻率較高，也是黑素瘤發(fā)病機制中的重要驅(qū)動因素[7]。BRAF(V600E)可激活并維持色素痣中黑素細胞的增殖分化，同時還會誘導(dǎo)p16反應(yīng)，出現(xiàn)細胞衰老現(xiàn)象(oncogene-induced Senescence，OIS)[6]，從而阻止黑素細胞的持續(xù)性增殖[13],機體通過這種生理性的動態(tài)平衡機制維持黑素細胞的良性增殖。但這種抑制是可逆的，當痣細胞出現(xiàn)p16INK4A 失活或者PI3K通路活化后，會逃脫這種抑制作用而轉(zhuǎn)化為惡性黑素瘤[14]。本研究中，所有BRAF(V600E)突變的CMN均是良性的，目前沒有惡變的臨床和病理學證據(jù)，說明這些CMN仍然處于良性的增殖狀態(tài)。隨著年齡的增長，在日曬、摩擦刺激等因素作用下，如果平衡狀態(tài)下的痣細胞出現(xiàn)p16INK4A 失活或者PI3K通路活化，可能惡性發(fā)展，最終形成黑素瘤。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CMN的增殖活性與痣細胞巢的數(shù)量及痣細胞深度呈正相關(guān)，而與痣細胞巢的大小無關(guān)。因此，痣細胞巢的數(shù)量可能是痣細胞增殖活性的一個重要指標，可用于今后的研究中。本研究表明BRAF(V600E)基因突變可顯著增強兒童CMN的增殖活性，并影響其組織病理學特征。而另一方面，CMN的組織病理學特征可以反映其分子學背景的相關(guān)信息。對CMN基因型-表型相關(guān)性的進一步研究，將有助于臨床上對不同類型的CMN采取更加科學的管理和治療方法。