劉軒綺，劉匯洋，霍銀萍，白 力，王永福

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種全身性自身免疫性疾病，該病的全球患病率約0.5 %～1.0 %，不同人群之間的差異很大[1]。其特征是關(guān)節(jié)受累，伴有進(jìn)行性軟骨和骨破壞，除關(guān)節(jié)受累外，還可伴有關(guān)節(jié)外器官受累，如血管炎、結(jié)節(jié)、眼病和間質(zhì)性肺病等，其中以肺受累最為嚴(yán)重。遺傳和環(huán)境因素均參與RA發(fā)病機(jī)制，目前RA的病因尚不完全清楚。

在RA的早期階段，中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)關(guān)節(jié)腔，積聚于滑膜組織和液體中。滑膜區(qū)中性粒細(xì)胞的存在與關(guān)節(jié)炎癥的早期臨床表現(xiàn)相關(guān)，提示中性粒細(xì)胞在RA的啟動(dòng)中起重要作用[2]。在炎癥性疾病中，當(dāng)中性粒細(xì)胞被細(xì)胞因子、趨化因子和自身抗體不恰當(dāng)?shù)丶せ顣r(shí)[3]，可釋放中性粒細(xì)胞外捕獲網(wǎng)(neutrophil extratrapping networks，NETs)提供自身抗原的來(lái)源[4]，并產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[5]。

中性粒細(xì)胞NETs的形成過(guò)程(NETosis)與RA疾病的進(jìn)展密切相關(guān)[6]，研究發(fā)現(xiàn)，RA外周血和滑膜液中性粒細(xì)胞中的NETosis增強(qiáng)[7]，此外，NETs可放大RA患者滑膜中的有害炎癥反應(yīng)[8]。NETs已被證實(shí)可加速RA疾病的進(jìn)展[9],鑒于RA對(duì)NETs的高特異性(92 %)和敏感性(91 %)[10]，NETs可作為RA早期診斷的一種潛在的新型生物標(biāo)志物。

本研究探索下調(diào)中性粒細(xì)胞能否緩解膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)小鼠模型疾病程度，同時(shí)結(jié)合測(cè)序分析RA患者NETs形成后的轉(zhuǎn)錄組差異，為關(guān)于NETs影響RA疾病進(jìn)展的后續(xù)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1動(dòng)物與試劑 雄性DBA1小鼠(8周齡)購(gòu)自南京大學(xué)動(dòng)物模型研究中心。CIA造模成功后將小鼠隨機(jī)分為2組，5只/組。WT組：即未經(jīng)任何處理的DBA1小鼠，CIA組：即膠原誘導(dǎo)的CIA小鼠；Anti-Ly6G組：即注射anti-Ly6G藥物的CIA小鼠。鼠抗Gr-1(Ly6G/Ly6C)單克隆抗體購(gòu)于BioXCell公司，EasySepTM人類(lèi)中性粒細(xì)胞分選試劑盒購(gòu)于STEMCELL公司，抗瓜氨酸H3抗體和FITC熒光二抗購(gòu)于Abcam公司，DAPI購(gòu)于Invitrogen公司。牛二型膠原蛋白(CⅡ)和弗氏完全佐劑(CFA)購(gòu)自Chondrex(美國(guó)華盛頓州雷德蒙德)。

1.2小鼠實(shí)驗(yàn)

1.2.1CIA造模 本研究嚴(yán)格按照CIA小鼠建立模型標(biāo)準(zhǔn)化原則進(jìn)行。(1)將7.605 mL去離子水中加入45 μL冰乙酸，稀釋為本實(shí)驗(yàn)所需最終濃度0.1 mol/L，隨后取7.5 mL混合液，加入牛Ⅱ型膠原，吹打至完全溶解，配制為2 mg/mL，置4 ℃冰箱中過(guò)夜備用；(2)用2 mL螺口注射器，將7.5 mL的牛Ⅱ型膠原與7.5 mL完全弗氏佐劑置于冰上混合乳化；(3)判斷乳化成功與否：將乳化好的膠原滴一滴在水面上，液滴不散，且邊緣隆起，說(shuō)明乳化成功；如果液滴分散，且邊緣扁平，則乳化不成功，繼續(xù)在冰上乳化；(4)用1 mL螺口注射器，于距小鼠尾根部2 cm處進(jìn)針，行皮內(nèi)注射，每只小鼠注射100 μL乳化成功的膠原和完全弗氏佐劑混合物；(5)21 d后進(jìn)行第2次免疫，步驟同第1次免疫；(6)28 d小鼠的關(guān)節(jié)會(huì)出現(xiàn)紅腫，即造模成功。

1.2.2中性粒細(xì)胞敲減實(shí)驗(yàn) DBA1鼠加強(qiáng)免疫后，對(duì)CIA小鼠以10 μg/g的劑量進(jìn)行腹腔內(nèi)注射抗LY6G單克隆抗體，1次/周，連續(xù)4周。

1.2.3組織學(xué)染色 在第4周末處死小鼠，收集小鼠肺及脾組織，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE染色)評(píng)估。分離小鼠后肢，并將關(guān)節(jié)固定于福爾馬林中，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，番紅固綠染色，根據(jù)滑膜組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量、蛋白多糖損失的程度以及關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕的程度對(duì)關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)變化進(jìn)行評(píng)估。

1.3測(cè)序 收集4名包頭市包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科RA患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：遵循1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)；參與本實(shí)驗(yàn)的患者充分了解該研究的實(shí)驗(yàn)原理及目的，自愿參加本研究。本實(shí)驗(yàn)所有參與者均簽署了知情同意書(shū)，同時(shí)，本項(xiàng)課題相關(guān)研究經(jīng)過(guò)我校倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。采集2 mL RA患者靜脈血，于枸櫞酸鈉抗凝管或EDTA抗凝管中，充分混勻。利用EasySepTM人類(lèi)中性粒細(xì)胞分選試劑盒采集RA患者外周血中性粒細(xì)胞(磁珠分選)。棄上清，沉淀中加入1 mL Trizol，標(biāo)記對(duì)照組(RA_control)與刺激組(RA_PMA)，細(xì)胞在液氮中快速冷凍，送至華大公司進(jìn)行基因測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果通過(guò)R軟件“DESeq2”包進(jìn)行差異基因篩選。

1.4免疫熒光染色

1.4.1基礎(chǔ)步驟 取200 μL 0.01 %多聚賴(lài)氨酸均勻涂于培養(yǎng)底物的表面，將磁珠分選法得到的RA外周血中性粒細(xì)胞離心移至培養(yǎng)板中，隨后加入4 %多聚甲醛固定15 min，繼續(xù)加入0.5 % Triton室溫靜置15 min，最后用1 % BSA室溫封閉30 min，加入配制好的一抗避光孵育過(guò)夜后，隔日孵育二抗及DAPI染料，倒置顯微鏡下觀察。

1.4.2濃度梯度實(shí)驗(yàn) 利用磁珠分選法收集RA患者外周血中性粒細(xì)胞，加入佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs，分別用8 nmol/L、16 nmol/L、24 nmol/L、32 nmol/L PMA刺激24孔板中1.5×106中性粒細(xì)胞懸液，放置于5 %二氧化碳培養(yǎng)箱孵育2 h，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗2～3次，5 min/次，熒光倒置顯微鏡觀察NETs形成情況。

2 結(jié)果

2.1中性粒細(xì)胞下調(diào)影響CIA小鼠疾病進(jìn)展 番紅固綠染色顯示，相較于WT組，CIA組小鼠關(guān)節(jié)軟骨層完整性破壞，軟骨細(xì)胞分布紊亂，關(guān)節(jié)間隙變狹窄；Anti-Ly6G組小鼠較CIA組的骨破壞程度有所緩解。見(jiàn)圖1。

圖1 中性粒細(xì)胞敲減對(duì)CIA小鼠滑膜關(guān)節(jié)組織的影響

與WT組相比，CIA組小鼠肺泡間隙增大，出現(xiàn)大范圍的斷裂；敲減中性粒細(xì)胞組(Anti-Ly6G組)肺泡間隙較CIA組變小，肺病理變化有所改善。見(jiàn)圖2。

圖2 中性粒細(xì)胞敲減對(duì)CIA小鼠肺組織的影響

WT組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)完整，紅髓和白髓之間界限清晰，脾小梁形態(tài)和數(shù)量正常，細(xì)胞分布均勻致密；CIA組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)破壞明顯，紅髓縮小，脾竇區(qū)擴(kuò)張，脾小梁數(shù)量明顯減少；與CIA組相比，Anti-Ly6G組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)破壞緩解，紅髓相對(duì)變大，脾小梁數(shù)量有所增加，脾臟病理變化均有所改善。見(jiàn)圖3。

圖3 中性粒細(xì)胞敲減對(duì)CIA小鼠脾臟的影響

2.2中性粒細(xì)胞形態(tài)特征 利用磁珠分選法分離RA患者外周血中性粒細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)，利用DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察到絕大多數(shù)為分葉核的中性粒細(xì)胞，具備中性粒細(xì)胞的基本形態(tài)。見(jiàn)圖4。

圖4 RA患者外周血中性粒細(xì)胞形態(tài)(40×)

2.3誘導(dǎo)NETs形成最佳濃度 8 nmol/L PMA刺激RA外周血中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs典型的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，16 nmol/L、24 nmol/L、32 nmol/L PMA刺激產(chǎn)生纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交錯(cuò)、呈云霧狀。因此8 nmol/L PMA刺激RA外周血中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs效果最好。見(jiàn)圖5。

圖5 PMA誘導(dǎo)RA患者外周血中性粒細(xì)胞NETs的情況(10×)

2.4RA-NETs存在轉(zhuǎn)錄組差異 將測(cè)序結(jié)果通過(guò)R語(yǔ)言“DESeq2”包進(jìn)行差異基因篩選，對(duì)照組和刺激組篩選得到2 742個(gè)差異基因(P≤0.05)，其中包括1 579個(gè)上調(diào)差異基因[log2(RA_control/RA_PMA>0)]和1 163個(gè)下調(diào)差異基因[log2(RA_control/RA_PMA<0]。見(jiàn)圖6。

圖6 RA中性粒細(xì)胞NETs差異基因火山圖及熱圖

為篩選出差異倍數(shù)更顯著的差異基因，將差異倍數(shù)定為-2≥log2(RA_control/RA_PMA)≥2，篩選出340個(gè)差異基因。將符合條件的差異基因繪制PPI圖(圖7)，隨后進(jìn)行GO和KEGG富集分析，GO分析結(jié)果如圖8A-C所示，分子功能中意義最顯著的為細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、蛋白綁定和CCR趨化因子受體綁定(圖8A)；細(xì)胞組分中意義最顯著的為細(xì)胞外區(qū)和細(xì)胞外空間(圖8B)；生物過(guò)程中意義最顯著的為免疫回應(yīng)和信號(hào)受體活性的調(diào)控(圖8C)。KEGG分析結(jié)果如圖8D所示，富集最顯著的通路為細(xì)胞因子之間相互調(diào)控通路。為進(jìn)一步探索340個(gè)差異基因富集的具體關(guān)系，利用GSEA軟件中C2 KEGG數(shù)據(jù)集對(duì)刺激組的高低表達(dá)基因進(jìn)行基因富集對(duì)比，基因組篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，結(jié)果如圖8E-G所示，GSEA分析得到大多數(shù)與刺激組呈正相關(guān)的富集基因組位于細(xì)胞因子受體互作、凋亡和Toll樣受體信號(hào)通路中。

圖7 差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)

圖8 差異基因的GO、KEGG以及GSEA分析

3 討論

中性粒細(xì)胞是炎癥發(fā)生早期首先進(jìn)入炎癥部位的免疫細(xì)胞。在RA早期，中性粒細(xì)胞遷移到關(guān)節(jié)腔內(nèi)，并在RA滑膜炎癥過(guò)程中發(fā)揮功能，加重RA的骨破壞，介導(dǎo)RA疾病進(jìn)展[11]。中性粒細(xì)胞在活動(dòng)性疾病患者炎癥關(guān)節(jié)中的免疫細(xì)胞中通常占最大比例[12]。研究發(fā)現(xiàn)，PMN計(jì)數(shù)高的RA患者生存期短[13]，Wang等[14]證實(shí)基于外周血中性粒細(xì)胞為載體的制劑對(duì)RA起到有效的抗炎作用。本研究通過(guò)構(gòu)建CIA小鼠模型，對(duì)小鼠中性粒細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)敲減發(fā)現(xiàn)，CIA小鼠中性粒細(xì)胞敲減使關(guān)節(jié)間隙相對(duì)CIA組變窄，軟骨受損程度減輕；小鼠的肺、脾組織病變程度有所緩解，證實(shí)了中性粒細(xì)胞敲減后，CIA疾病狀態(tài)部分減輕。

NETs是中性粒細(xì)胞外捕獲網(wǎng)結(jié)構(gòu)，當(dāng)中性粒細(xì)胞遇到體積大、數(shù)量多、超過(guò)中性粒細(xì)胞快速處理能力的外來(lái)病原微生物感染時(shí)，中性粒細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)自身NETs[15]。大量學(xué)者提出可將NETs作為靶點(diǎn)研發(fā)RA的新型治療手段[16]，但NETs影響RA進(jìn)展的具體機(jī)制尚未完全清晰。本研究通過(guò)體外收集人外周血中性粒細(xì)胞，進(jìn)行DAPI染色，證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)收集的細(xì)胞符合中性粒細(xì)胞基本形態(tài)。為進(jìn)一步探究中性粒細(xì)胞NETs在RA發(fā)病中的作用，首先通過(guò)誘導(dǎo)RA NETs實(shí)驗(yàn)確定了誘導(dǎo)物PMA刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs的最佳濃度為8 nmol/L，隨后通過(guò)對(duì)RA中性粒細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)設(shè)置組別為RA_contro組和RA_PMA組，對(duì)兩組進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)340個(gè)基因具有差異性。將340個(gè)差異基因繪制PPI圖，展示了它們之間的相關(guān)性，并對(duì)其進(jìn)行了KEGG富集分析以及GSEA分析。我們發(fā)現(xiàn)340個(gè)差異基因主要富集在細(xì)胞因子受體互作、凋亡和Toll樣受體信號(hào)通路中。

細(xì)胞因子是一種存在于細(xì)胞外的小分子多肽，參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等生理活動(dòng)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在RA發(fā)病過(guò)程中，細(xì)胞因子是炎癥、組織損傷以及免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)。研究表明，細(xì)胞因子可促進(jìn)NETs的產(chǎn)生，同時(shí)NETs可降解細(xì)胞因子，從而減輕炎癥[17]。細(xì)胞凋亡發(fā)生于許多生物體生理變化過(guò)程中，是一種受?chē)?yán)格調(diào)控的能量依賴(lài)性的程序性死亡。自噬也是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制，是形成NETs的先決條件之一，自噬被抑制會(huì)阻礙NETosis的進(jìn)程[18]。同時(shí)，在RA中Toll樣受體信號(hào)通路通過(guò)激活核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和Janus激酶信號(hào)傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase signal transducers and activators of transcription,JAK-STAT)信號(hào)通路導(dǎo)致炎癥進(jìn)行性發(fā)生，引起滑膜增生和軟骨的侵蝕[19]，且NETs可通過(guò)Toll樣受體激活炎癥，觸發(fā)靜脈血栓形成。本研究通過(guò)生物信息學(xué)結(jié)果證實(shí)NETs的形成與以上的免疫過(guò)程相關(guān)性高，表明NETs的形成可能通過(guò)以上的免疫過(guò)程對(duì)RA疾病進(jìn)展起到作用。

綜上所述，下調(diào)中性粒細(xì)胞可緩解CIA小鼠疾病關(guān)節(jié)滑膜、肺及脾的病理改變，RA的NETs形成與免疫調(diào)控、凋亡以及細(xì)胞因子之間相互作用、凋亡和Toll樣受體信號(hào)通路相關(guān)，表明NETs的形成可能參與以上免疫過(guò)程，對(duì)RA疾病進(jìn)展起重要的作用。未來(lái)我們可以通過(guò)研究RA患者NETs與這些通路之間的相關(guān)性，探索NETs介導(dǎo)RA疾病發(fā)展的可能機(jī)制。