楊雪苗，薄彧坤，楊 丹，張淑寧，郭博宇，安 明1,

(1.蒙藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2020級(jí)研究生)

肺纖維化是一種呈進(jìn)行性、不可逆轉(zhuǎn)性發(fā)展的肺間質(zhì)性呼吸系統(tǒng)疾病，也是肺部疾病中高發(fā)病率和病死率的主要原因，具有多致病因素且病因未明的特點(diǎn)，是各種慢性肺部疾病的終末期病理特征。肺纖維化是因藥物毒性、自身免疫性、感染性等因素[1]導(dǎo)致的肺組織結(jié)構(gòu)破壞，后經(jīng)人體自我異常修復(fù)產(chǎn)生瘢痕組織的結(jié)果[2]。肺纖維化的發(fā)生與炎性介質(zhì)致肺泡上皮細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞的募集、活化以及大量細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度聚集有關(guān)[3]。目前尚未發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)肺纖維化的藥物，只能通過(guò)改善其臨床癥狀緩解纖維化進(jìn)程，因此，探索可以抑制肺纖維化發(fā)展的有效藥物迫在眉睫。

近年來(lái)，隨著對(duì)肺纖維化研究的不斷深入，利用中蒙藥對(duì)肺纖維化進(jìn)行治療的研究逐漸增多。蒺藜(Tribulus terrestris L.)是蒺藜科的干燥成熟果實(shí)，已被用作中草藥預(yù)防疾病數(shù)千年，常用于補(bǔ)腎、止咳、祛痰、明目和眩暈，可以治療尿路感染、不孕癥、陽(yáng)痿等[4]。蒺藜皂苷D是蒺藜中提取分離出的一種甾體皂苷，具有廣泛的藥理作用，其可通過(guò)抑制神經(jīng)傳遞介質(zhì)與樹(shù)突狀細(xì)胞的相互作用，降低樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)水平[5]，還能通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞周期阻滯和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡發(fā)揮抗腫瘤和抗血管生成活性的藥理作用[6]，因此，蒺藜皂苷D具有明顯的抗炎和抗癌活性，但蒺藜皂苷D對(duì)肺纖維化保護(hù)作用的研究甚少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個(gè)相對(duì)較新的學(xué)科，它通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息來(lái)闡明藥物的分子相互作用，并且是研究復(fù)雜草藥制劑作用機(jī)制的有力工具，已成功應(yīng)用于研究中藥制劑的作用機(jī)制，并通過(guò)了體外和體內(nèi)驗(yàn)證。分子對(duì)接是通過(guò)受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來(lái)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的方法，主要研究分子間(如配體和受體)相互作用，并預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法[7]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的研究方法，從分子水平上探討蒺藜皂苷D治療肺纖維化的作用機(jī)制，為蒺藜皂苷D治療肺纖維化提供理論依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)庫(kù)、軟件與方法

1.1數(shù)據(jù)庫(kù) 本研究部分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是通過(guò)網(wǎng)絡(luò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，數(shù)據(jù)庫(kù)具體名稱的網(wǎng)址見(jiàn)表1。

表1 網(wǎng)絡(luò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)名稱及網(wǎng)址

1.2軟件 操作系統(tǒng)：Windows 10 (64位)操作系統(tǒng)。Cytoscape 3.7.2：一個(gè)將蛋白-蛋白互作(PPI)

網(wǎng)絡(luò)、ClueGO分析和蒺藜皂苷D-潛在靶點(diǎn)-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)可視化的軟件，并將這些網(wǎng)絡(luò)、注釋與其他狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和可視化。Autodock：一個(gè)用于模擬小分子配體(活性成分)與大分子受體(潛在靶點(diǎn))通過(guò)幾何匹配和能量匹配產(chǎn)生相互作用的軟件。Autodock具有對(duì)接速度快和對(duì)接質(zhì)量高的優(yōu)點(diǎn)，是分子對(duì)接領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛的軟件之一。PyMOL-2.5.2：是用于分子對(duì)接研究中對(duì)受體和配體進(jìn)行預(yù)處理和將分子對(duì)接結(jié)果可視化的軟件。

1.3方法

1.3.1靶點(diǎn)的收集 利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)收集已知的成分靶點(diǎn)。具體操作過(guò)程為：使用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)查詢蒺藜皂苷D的Canonical SMILES序列，然后導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)，Species選擇Homo sapiens，結(jié)果篩選Probability>0的靶點(diǎn)作為蒺藜皂苷D的治療靶點(diǎn)。為獲得更多的藥物靶點(diǎn)，通過(guò)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)以“Terrestrosin D”為關(guān)鍵詞進(jìn)行文獻(xiàn)檢索以收集蒺藜皂苷D更多的潛在作用靶點(diǎn)。

以“pulmonary fibrosis”為關(guān)鍵詞，在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索肺纖維化的相關(guān)疾病靶點(diǎn)，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)合并，同時(shí)刪除重復(fù)項(xiàng)，最終獲得肺纖維化疾病靶點(diǎn)。

1.3.2韋恩(Venn)圖的構(gòu)建 獲得蒺藜皂苷D作用靶點(diǎn)與肺纖維化作用靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，并繪制Venn圖，以篩選蒺藜皂苷D-肺纖維化共同靶點(diǎn)。

1.3.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將交集靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(gene symbol)，然后輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，Organism選擇“Homo sapiens”，采用Cytoscape 3.7.2軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)圖可視化并使用“Network Analyzer”工具進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.3.4靶點(diǎn)功能注釋分析 利用Cytoscape 3.7.2軟件中“ClueGO”工具對(duì)得到的交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)分析并對(duì)其功能進(jìn)行注釋，選擇“Organism”為“homo sapiens”，設(shè)置閾值P<0.05。其中GO分析包括生物過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個(gè)過(guò)程。

1.3.5靶點(diǎn)通路注釋分析 為明確潛在靶點(diǎn)的作用途徑，通過(guò)生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(DAVID)進(jìn)行基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析，選擇“homo sapiens”。為獲得重要作用的信號(hào)通路，選取作用中重要性排名前15的信號(hào)通路通過(guò)微生信在線作圖工具可視化KEGG網(wǎng)絡(luò)。

1.3.6蒺藜皂苷D-靶點(diǎn)-肺纖維化-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將蒺藜皂苷D-肺纖維化的交集靶點(diǎn)及信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建蒺藜皂苷D-靶點(diǎn)-肺纖維化-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)其進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.3.7分子對(duì)接 整合“1.3.3”中排名前8的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。采用AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接以模擬蒺藜皂苷D與肺纖維化相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用。配體小分子(蒺藜皂苷D)的三維結(jié)構(gòu)(3D-SDF)由PubChem(PubChem CID:101995328)獲得，通過(guò)PyMOL軟件轉(zhuǎn)化為PDB格式。受體(靶點(diǎn)蛋白)的三維結(jié)構(gòu)文件由PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，為避免下載的蛋白晶體結(jié)構(gòu)攜帶其他小分子配體和溶劑，導(dǎo)入PyMOL軟件后將其去除并轉(zhuǎn)化為PDB格式。分別將配體和受體PDB格式導(dǎo)入AutoDock軟件，通過(guò)加入氫原子和去除水分子來(lái)優(yōu)化結(jié)構(gòu)，并保存為PDBQT格式文件。最后，運(yùn)行AutoDock軟件中“AutoDock Vina”程序?qū)ε潴w和受體進(jìn)行分子對(duì)接。

根據(jù)配體小分子(蒺藜皂苷D)與受體(靶點(diǎn)蛋白)的結(jié)合自由能大小來(lái)評(píng)估二者的自發(fā)結(jié)合能力，最小結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol被認(rèn)為二者可以自發(fā)進(jìn)行結(jié)合。將符合條件的分子對(duì)接結(jié)果導(dǎo)出并進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1潛在靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)查閱文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)收集共獲得43個(gè)與蒺藜皂苷D相關(guān)的作用靶點(diǎn)。刪除重復(fù)項(xiàng)后，DrugBank、OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得1 492個(gè)與肺纖維化相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

2.2Venn圖的構(gòu)建 將“2.1”獲得的蒺藜皂苷D和肺纖維化相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行整合，獲得二者共同作用的靶點(diǎn)17個(gè)，作為蒺藜皂苷D治療肺纖維化的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)在線網(wǎng)絡(luò)繪制Venn圖，見(jiàn)圖1。17個(gè)潛在靶點(diǎn)包括HTR2B、HTR2A、CYP2D6、HTR1B、HSP90AA1、PSEN2、STAT3、VEGFA、FGF1、FGF2、VDR、LGALS3、MAPK3、IL6、PPARG、TNF和TGFβ1。

圖1 蒺藜皂苷D-肺纖維化靶點(diǎn)Venn圖

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)分析 為鑒定蒺藜皂苷D抗肺纖維化的中心靶點(diǎn)，采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化。如圖2所示，網(wǎng)絡(luò)包含15個(gè)節(jié)點(diǎn)(靶蛋白)，58條邊(蛋白間的相互作用)，聚類系數(shù)(Clustering coefficient)為0.715，平均節(jié)點(diǎn)度(Avg.number of neighbors)為7.733。根據(jù)度值(Degree)篩選對(duì)該網(wǎng)絡(luò)貢獻(xiàn)較大、作用較顯著的靶點(diǎn)，度值排名前8的潛在靶點(diǎn)分別為MAPK3、PPARG、IL6、TNF、VEGFA、TGFβ1、FGF2和STAT3。節(jié)點(diǎn)越大、線條越粗，相應(yīng)的顏色越深，表明其在該網(wǎng)絡(luò)中的貢獻(xiàn)程度越大。上述結(jié)果表明，蒺藜皂苷D可能通過(guò)多靶點(diǎn)的協(xié)同作用發(fā)揮抗肺纖維化的療效。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4靶點(diǎn)功能注釋分析 為更好地闡明蒺藜皂苷D對(duì)肺纖維化的保護(hù)作用，將“2.2”中獲得的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析。GO分析篩選得到BP條目418條，CC條目22條，MF條目29條。BP包括脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝過(guò)程的正向調(diào)節(jié)和對(duì)脂質(zhì)生物合成過(guò)程的調(diào)節(jié)等；CC包括免疫突觸、小凹、白細(xì)胞介素-6受體復(fù)合物、血小板等；MF包括RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和生長(zhǎng)因子活性等，重要過(guò)程展示見(jiàn)圖3。

圖3 GO功能富集結(jié)果圖

2.5靶點(diǎn)通路注釋分析 將“2.2”中獲得的交集靶點(diǎn)通過(guò)DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG富集分析，共富集到69條信號(hào)通路，包括與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)和PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)等；與免疫系統(tǒng)(immune system)相關(guān)的有Th17細(xì)胞分化(Th17 cell differentiation)；與神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)相關(guān)通路有5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse)；本研究?jī)H對(duì)影響顯著的前15條通路進(jìn)行展示，具體見(jiàn)圖4，詳細(xì)參數(shù)見(jiàn)表2。

圖4 KEGG富集分析結(jié)果圖

表2 KEGG通路富集信息

2.6蒺藜皂苷D-靶點(diǎn)-肺纖維化-通路網(wǎng)絡(luò)分析 為進(jìn)一步說(shuō)明蒺藜皂苷D與肺纖維化間的相關(guān)性，使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建了蒺藜皂苷D-靶點(diǎn)-肺纖維化-通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。該網(wǎng)絡(luò)由83個(gè)節(jié)點(diǎn)和293條邊組成，其網(wǎng)絡(luò)集中化(network centralization)和網(wǎng)絡(luò)質(zhì)性(network heterogeneity)參數(shù)分別是0.587和1.273。圖中綠色節(jié)點(diǎn)表示肺纖維化，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示蒺藜皂苷D，黃色節(jié)點(diǎn)表示疾病與活性成分的交集靶點(diǎn)，紅色節(jié)點(diǎn)表示交集靶點(diǎn)可能作用的信號(hào)通路，每條邊表示活性成分與交集靶點(diǎn)之間的相互作用。

圖5 蒺藜皂苷D-靶點(diǎn)-肺纖維化-通路網(wǎng)絡(luò)圖

節(jié)點(diǎn)的貢獻(xiàn)和重要性通過(guò)Degree值和中介度值(Betweenness centrality)來(lái)評(píng)價(jià)。靶點(diǎn)MAPK3(Degree:11;Betweenness:1)、PPARG(Degree:11;Betweenness:1)、IL6(Degree:11;Betweenness:1)、TNF(Degree:11;Betweenness:1)、VEGFA(Degree:11;Betweenness:1)、TGFβ1(Degree:10;Betweenness:0.92)、FGF2(Degree:9;Betweenness:0.85)、STAT3(Degree:9;Betweenness:0.85)等具有較高的Degree值和中介度值，上述靶點(diǎn)主要參與了與肺纖維化相關(guān)的MAPK信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路等。以上結(jié)果表明，蒺藜皂苷D通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮抗肺纖維化的作用。

2.7分子對(duì)接 本研究中，F(xiàn)GF2、MAPK3、TGFβ1、TNF和IL6等核心靶點(diǎn)富集于MAPK信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路，結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出度值排名前8的潛在靶點(diǎn)MAPK3、FGF2、TGFβ1、TNF、STAT3、VEGFA、IL6和PPARG進(jìn)行分子對(duì)接研究，并采用PyMol軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理。藍(lán)色背景代表各潛在靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，綠色代表蒺藜皂苷D結(jié)構(gòu)，黃色代表蒺藜皂苷D與靶蛋白間的氫鍵。見(jiàn)圖6，MAPK3與ARG-278、GLN-266、GLU-351、ASP-354、ASP-353殘基形成氫鍵；FGF2與LEU-57、LYS-67、GLN-55、ASN-105殘基形成氫鍵；STAT3與RHE-50、GLU-87殘基形成氫鍵；IL6與AGL-30、LYS-27、ARG-24、GLU-23、THR-20、LEU-19殘基形成氫鍵；PPARG與LYS-373、SER-380、PRO-378、GLU-388殘基形成氫鍵。分子對(duì)接結(jié)果表明，蒺藜皂苷D可以靶向作用于MAPK3、FGF2、STAT3、IL6和PPARG等靶點(diǎn)發(fā)揮抗肺纖維化的作用。蒺藜皂苷D與各靶蛋白的對(duì)接的結(jié)合能見(jiàn)表3。

圖6 分子對(duì)接結(jié)果圖

表3 蒺藜皂苷D與核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果

3 討論

本文是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接的研究方法探究蒺藜皂苷D抗肺纖維化的作用機(jī)制。通過(guò)度值大小篩選出MAPK3、PPARG、IL6、TNF、VEGFA、TGFβ1、FGF2和STAT3等靶點(diǎn)為蒺藜皂苷D治療肺纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。TNF-α作為一種重要的致炎因子，能活化巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，促進(jìn)膠原纖維的過(guò)度增生和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，加速肺纖維化病理進(jìn)程，同時(shí)TNF-α可刺激其他炎癥因子的表達(dá)，增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的增殖，膠原的合成[8]。在腫瘤發(fā)展中TNF-α可增強(qiáng)TGF-β的表達(dá)，TGF-β在臟器纖維化過(guò)程中扮演著重要角色，TGF-β的激活是間質(zhì)增生的誘因，是肺纖維化炎癥反應(yīng)向纖維化病理過(guò)程轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵介質(zhì)，在纖維化中發(fā)揮“總開(kāi)關(guān)”作用。TGF-β1可以刺激細(xì)胞增殖和活化，分泌大量的膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分促使臟器發(fā)生纖維化[9]。張娜等[10]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)用TGF-β1誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞間質(zhì)纖維化，表明TGF-β1是肺纖維化的誘因之一。VEGFA是血管生成劑之一，肺纖維化的發(fā)生伴有血管生成異常的現(xiàn)象和VEGFA蛋白表達(dá)的增加。因此，抑制VEGF的激活可以緩解肺纖維化的發(fā)生進(jìn)程[11]。

在肺纖維化發(fā)展過(guò)程中，脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)會(huì)被破壞。正常細(xì)胞大多數(shù)依靠從血流中攝取脂肪酸和脂蛋白來(lái)滿足其脂質(zhì)需求，而異常細(xì)胞會(huì)重新激活脂質(zhì)生物合成，以促進(jìn)細(xì)胞膜的生成，并支持其生長(zhǎng)增殖，最終導(dǎo)致脂質(zhì)合成及代謝異常。GO富集結(jié)果表明，蒺藜皂苷D發(fā)揮治療肺纖維化的藥效機(jī)制可能與脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝過(guò)程的正向調(diào)節(jié)和對(duì)脂質(zhì)生物合成過(guò)程的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程有關(guān)。

PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路是肺纖維化發(fā)生發(fā)展中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PI3K-Akt信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞自噬過(guò)程的重要途徑，而肺纖維化被認(rèn)為伴有自噬現(xiàn)象，肺組織損傷后會(huì)進(jìn)行修復(fù)，局部活化的肺成纖維細(xì)胞會(huì)分泌膠原蛋白完成組織修復(fù)，之后基質(zhì)膠原蛋白收縮產(chǎn)生刺激信號(hào)誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而避免肺成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖、膠原蛋白異常沉積，阻止肺纖維化的發(fā)生?，F(xiàn)有證據(jù)表明，TGF-β和PI3K-Akt的相互作用促進(jìn)肺纖維化的形成[12]。MAPK信號(hào)通路是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，該通路在炎癥、腫瘤等一系列疾病的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，此外，其在許多主要器官的纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如心肌纖維化、腎纖維化和肺纖維化[13-14]。TGF-β、TNF-α等細(xì)胞因子的生成與MAPK信號(hào)通路的激活有密切聯(lián)系，MAPK信號(hào)通路的激活又會(huì)促使各細(xì)胞因子的大量生成，從而加速肺纖維化的發(fā)展[15]。

綜上所述，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接的方法顯示，蒺藜皂苷D可能通過(guò)MAPK3、FGF2、TGFβ1、TNF、STAT3、VEGFA、IL6、PPARG等靶點(diǎn)作用于EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等，發(fā)揮抗炎、抗肺纖維化的藥理作用；蒺藜皂苷D與受體MAPK3、FGF2、STAT3、IL6和PPARG的結(jié)合活性較高。蒺藜皂苷D治療肺纖維化通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用，該研究為蒺藜皂苷D治療肺纖維化的深入研究提供了理論基礎(chǔ)。