李 鑫，蔚立濤，趙秉宏，高 磊，關(guān)明杰

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院2019級(jí)研究生，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院2018級(jí)研究生；3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院)

注意缺陷多動(dòng)障礙(attention deficit and hyperactivity disorder,ADHD)又稱多動(dòng)癥，是學(xué)齡前、學(xué)齡期兒童常見(jiàn)的一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，以注意力集中時(shí)間短、多動(dòng)或沖動(dòng)為核心特征?；純撼０殡S學(xué)習(xí)成績(jī)差、社會(huì)功能受損，并且較正常兒童易出現(xiàn)各種認(rèn)知障礙、情緒障礙等問(wèn)題。據(jù)研究報(bào)道，兒童ADHD如沒(méi)有及時(shí)干預(yù)治療，約有65 %的癥狀會(huì)持續(xù)到成年，對(duì)兒童自身及其家庭，以及社會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在大腦中的含量極為豐富，且對(duì)大腦的正常發(fā)育及生理功能具有重要意義。大腦中BDNF的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[2]。研究發(fā)現(xiàn)BDNF/酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)/環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)通路作為BDNF調(diào)節(jié)認(rèn)知功能障礙的主要途徑，當(dāng)BDNF/TrkB/CREB通路存在異常時(shí)，同樣會(huì)引起神經(jīng)元損傷及認(rèn)知功能障礙[3]。此外，CREB的異常表達(dá)與認(rèn)知功能障礙也具有關(guān)聯(lián)性，CREB的激活可使新的突觸形成增多并增加學(xué)習(xí)記憶相關(guān)性蛋白表達(dá)[4]。因此，BDNF/TrkB/CREB通路的異常與ADHD具有相關(guān)性。

蒙古黃芪作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表等藥理作用。多糖作為蒙古黃芪主要有效成分，是蒙古黃芪發(fā)揮藥理作用的重要物質(zhì)之一。蒙古黃芪多糖是一種具有多靶點(diǎn)生物活性的大分子物質(zhì)，研究表明其具有抗炎、調(diào)節(jié)血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用，是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本課題組圍繞蒙古黃芪對(duì)ADHD的防治作用及機(jī)制展開(kāi)相關(guān)研究，前期研究發(fā)現(xiàn)蒙古黃芪多糖可減少大鼠前額葉神經(jīng)元損傷，影響多巴胺通路中多巴胺的合成及清除。本研究在原有研究的基礎(chǔ)上，探討蒙古黃芪多糖對(duì)ADHD模型大鼠(SHR大鼠)行為的影響及BDNF/TrkB/CREB mRNA的影響，進(jìn)一步明確蒙古黃芪多糖防治ADHD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物 蒙古黃芪多糖(簡(jiǎn)稱多糖)，采用水煮醇沉法提取，醇沉法(95 %乙醇)富集。具體方法參考本課題組前期蒙古黃芪多糖提取方法，通過(guò)UV檢測(cè)蒙古黃芪多糖含量為98.12 %[5]。靜靈口服液從遼寧東方人藥業(yè)有限公司購(gòu)入，哌甲酯專注達(dá)從西安楊森制藥有限公司購(gòu)入。

1.1.2儀器與試劑 試劑：尼氏染色液(北京索萊寶)，二甲苯(天市永大化學(xué)試劑有限公司)，中性樹(shù)膠(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，無(wú)水乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，TRNzol總RNA提取試劑(天根生化科技有限公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、DL2000 DNA Marker(TaKaRa)，ELISA試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)。儀器：光學(xué)顯微鏡(日本OLYMP-US)，石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡)，電腦生物組織攤烤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)，渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，離心機(jī)(Eppendorf)，分光光度計(jì)(Thermo scientific)、凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)，水迷宮實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)由泰盟軟件有限公司研制開(kāi)發(fā)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物及分組 SHR大鼠20只、Wistar大鼠5只，均為SPF級(jí)，雄性，4周齡，體質(zhì)量50～70 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)在屏障動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度、濕度適宜，12 h晝夜交替，自由飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)入[SCXK(京)2016-0006]。

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，將20只SHR大鼠采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方法分為4組，分別為模型組、多糖組、哌甲酯組、靜靈口服液組(靜靈組)，5只/組；5只Wistar大鼠為對(duì)照組。大鼠灌胃給藥，共4周，灌胃量10 mL/kg。給藥組分別給予多糖0.15 g/kg、哌甲酯2.0 mg/kg、靜靈口服液10 mL/kg，對(duì)照組和模型組給予10 mL/kg生理鹽水。

1.2.2行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 在給藥4周末進(jìn)行，將曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱的底部分為50 cm×50 cm的九宮格，定義為外圍區(qū)域、中心區(qū)域。實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始前使大鼠適應(yīng)周圍環(huán)境。30 min后將大鼠放入中心區(qū)域，通過(guò)視頻系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)大鼠的站立次數(shù)、理毛次數(shù)、糞便次數(shù)。

水迷宮實(shí)驗(yàn)于給藥第4周初進(jìn)行，于每日上午8點(diǎn)進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。將圓形水池人為劃分為4個(gè)象限，平臺(tái)位于第一象限內(nèi)，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠輕柔地放入水池，記錄大鼠在一定時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)的用時(shí)。記錄大鼠在2 min穿越平臺(tái)數(shù)、穿越象限數(shù)、游泳速度，以此分析各組大鼠的空間記憶和學(xué)習(xí)的能力。每次實(shí)驗(yàn)后及時(shí)將大鼠放入干燥溫暖的環(huán)境，確保大鼠正常生理狀態(tài)。

1.2.3尼氏染色 大鼠處死后取腦組織在冰上分離前額葉，置于4 %多聚甲醛中固定。制作石蠟切片，石蠟切片脫蠟于蒸餾水；在60 ℃預(yù)熱的1 %甲苯胺藍(lán)染色液中染色40 min；蒸餾水清洗；取70 %和80 %乙醇各浸洗2 min；95 %乙醇分化，顯微鏡下控制分色，直至清晰顯示出尼氏小體為止，背景淡藍(lán)色為宜；無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

1.2.4Real-time PCR檢測(cè)大鼠前額葉BDNF、TrkB、CREB mRNA的表達(dá) 用TRNzol RNA提取法提取大鼠前額葉RNA，紫外分光光度法檢測(cè)RNA濃度和純度，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件25 ℃ 10 min，42 ℃孵育50 min，85 ℃ 10 min。Real-time PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性，95 ℃，5 min；變性，95 ℃，10 s；退火，60 ℃，40 s；延伸95 ℃，15 s；變性、退火、延伸各循環(huán)40次，建立熔解曲線，所有樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5ELISA法檢測(cè)血清中IP3、FosB、c-Fos水平 大鼠經(jīng)腹腔注射3 %戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。腹主動(dòng)脈采血2 mL，靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取血清，采用ELISA法檢測(cè)血清IP3、FosB、c-Fos水平，操作嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)(武漢純度生物科技有限公司)。取試劑盒內(nèi)96孔板，依次設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔、空白孔，標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本，空白孔除外。各孔按照說(shuō)明書(shū)加入酶標(biāo)試劑，孵育1 h后，取洗滌液進(jìn)行5次洗板，然后進(jìn)行顯色處理，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明，各組大鼠游泳速度接近，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明各組大鼠游泳能力相近。模型組較對(duì)照組穿越平臺(tái)數(shù)、穿越象限數(shù)減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。多糖組、哌甲酯組、靜靈組較模型組穿越平臺(tái)數(shù)、穿越象限數(shù)增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組較站立次數(shù)、理毛次數(shù)增加(P<0.05)；與模型組相比，多糖組、哌甲酯組、靜靈組站立次數(shù)減少(P<0.05)，各給藥組之間站立次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，多糖組、靜靈組理毛次數(shù)減少(P<0.05)；與哌甲酯組相比，多糖組理毛次數(shù)減少(P<0.05)；模型組糞便粒數(shù)較其他四組增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.3尼氏染色結(jié)果 對(duì)照組神經(jīng)元尼氏體較多，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，尼氏體、細(xì)胞核染色清晰，邊界分明。模型組尼氏體數(shù)目減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，核膜偏倚、碎裂、不清晰。蒙古黃芪多糖組、哌甲酯組、靜靈組神經(jīng)元尼氏體較多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠前額葉尼氏染色(400×)

2.4血清IP3、FosB、c-Fos檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組IP3水平提高(P<0.05)；與模型組相比，多糖組、哌甲酯組IP3水平降低(P<0.05)；多糖組、靜靈組IP3水平高于哌甲酯組(P<0.05)；模型組較對(duì)照組FosB水平降低，多糖組、哌甲酯組、靜靈組較模型組FosB水平增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組c-Fos水平高于對(duì)照組(P<0.05)，多糖組、哌甲酯組、靜靈組c-Fos水平低于模型組(P<0.05)，多糖組c-Fos水平高于哌甲酯組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 大鼠血清IP3、FosB、c-Fos結(jié)果

2.5大鼠前額葉BDNF、TrkB、CREB mRNA的檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組大鼠前額葉BDNF mRNA、TrkB mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；多糖組、靜靈組BDNF mRNA表達(dá)水平較模型組提高(P<0.05)，哌甲酯組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，多糖組、靜靈組較哌甲酯組表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組較對(duì)照組TrkB mRNA表達(dá)減少(P<0.05)，多糖組、哌甲酯組、靜靈組TrkB mRNA水平與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組、多糖組較模型組CREB mRNA水平增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；哌甲酯組、靜靈組CREB mRNA較模型組增高(P<0.05)，哌甲酯組、靜靈組較多糖組CREB mRNA增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠BDNF、TrkB、CREB mRNA表達(dá)量結(jié)果(n=5)

3 討論

經(jīng)過(guò)多年研究，ADHD仍無(wú)確切病因因素及發(fā)病機(jī)制，認(rèn)為該病是由生物-心理-社會(huì)因素共同作用的結(jié)果。目前有研究表明，前額葉功能低下成為ADHD可能病因因素之一[6]。ADHD患兒存在自我調(diào)節(jié)、注意控制和反應(yīng)抑制能力等方面的功能障礙，而前額葉在反應(yīng)抑制、工作記憶、注意力及自主控制等人類的高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[7]。蒙古黃芪作為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材之一，有兩千多年的歷史，其主要成分包括黃酮、皂苷、多糖及氨基酸等多種生物活性物質(zhì)，其中多糖具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、抗炎等藥理學(xué)作用[8-9]。目前研究表明蒙古黃芪多糖可明顯改善抑郁模型大鼠的海馬損傷及抑郁行為，進(jìn)一步表明黃芪多糖對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有藥理作用[10]。

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞正常死亡類型，具有重要的生物學(xué)意義。神經(jīng)元異常數(shù)量的凋亡會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)學(xué)習(xí)、認(rèn)知、記憶等功能障礙。ADHD患兒呈現(xiàn)前額葉功能受損、發(fā)育緩慢以及體積異常[11]。本研究結(jié)果顯示，SHR大鼠焦慮程度增加，自發(fā)活動(dòng)增多，學(xué)習(xí)記憶能力減弱。而多糖組、哌甲酯組、靜靈組大鼠焦慮程度降低，自發(fā)活動(dòng)減少，對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善作用不明顯。尼氏染色結(jié)果顯示模型組大鼠前額葉尼氏體數(shù)目減少，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，核膜出現(xiàn)偏倚、碎裂、邊界不清晰的現(xiàn)象。與模型組相比，蒙古黃芪多糖組、哌甲酯組、靜靈口服液組尼氏體較多，細(xì)胞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰。因此，模型組大鼠表現(xiàn)出行為的改變可能與大鼠前額葉神經(jīng)元的損傷有關(guān)，蒙古黃芪多糖、哌甲酯、靜靈口服液可不同程度地減少前額葉細(xì)胞損傷，因而改善大鼠的異常行為。

FosB與c-Fos共屬于Fos蛋白家族，可與Jun蛋白家族二聚化形成活化蛋白(AP-1)，調(diào)控細(xì)胞的生命活動(dòng)。IP3作為影響細(xì)胞凋亡作用的重要載體蛋白，是FosB、c-Fos的上游信號(hào)通路因子，當(dāng)體內(nèi)損傷時(shí)，其表達(dá)量增高[12]。正常生理狀態(tài)下，c-Fos在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)水平較低，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)、外因素刺激后，可激活c-Fos基因轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞[11]。本研究顯示，蒙古黃芪多糖、哌甲酯、靜靈口服液可降低大鼠體內(nèi)IP3，對(duì)FosB無(wú)影響，有研究發(fā)現(xiàn)哌甲酯可提高SHR大鼠紋狀體等特定腦區(qū)的FosB的表達(dá)[13]。針對(duì)c-Fos的研究發(fā)現(xiàn)蒙古黃芪多糖、哌甲酯、靜靈口服液均可降低其水平，但有學(xué)者研究表明哌甲酯可提高前額葉皮層、前扣帶皮層的c-Fos表達(dá)[14]。本研究結(jié)果顯示，哌甲酯藥理作用與以往研究不同，分析可能原因是本次檢測(cè)樣本為血清，與腦組織樣本具有一定差異，具體原因仍需探究。本研究表明蒙古黃芪多糖對(duì)IP3、c-Fos具有影響作用，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

BDNF作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白家族的一員，參與未成熟神經(jīng)元的增殖、分化、成熟和存活，在記憶形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15]。TrkB是BDNF的高親和力受體，BDNF-TrkB信號(hào)可調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化、突觸形成以及結(jié)構(gòu)和功能的變化[16]。TrkB激活后可引起Ras或磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的活化，活化的Ras通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致CREB磷酸化[17]。CREB是一種參與大腦發(fā)育、神經(jīng)存活和神經(jīng)發(fā)生的主要轉(zhuǎn)錄因子，可引起B(yǎng)DNF磷酸化，從而調(diào)節(jié)BDNF的轉(zhuǎn)錄并影響學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，蒙古黃芪多糖、靜靈口服液可提高SHR大鼠前額葉中BDNF mRNA表達(dá)，哌甲酯、靜靈口服液可提高CREB表達(dá)水平，三種藥物對(duì)TrkB無(wú)影響作用，提示蒙古黃芪多糖、哌甲酯、靜靈口服液可通過(guò)調(diào)節(jié)BDNF mRNA、CREB mRNA的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)SHR大鼠前額葉BDNF/TrkB/CREB信號(hào)通路。

綜上所述，大鼠在水迷宮及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的行為改變，可能與蒙古黃芪多糖增加SHR大鼠前額葉中BDNF mRNA的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)BDNF/TrkB/CREB信號(hào)通路，降低IP3、c-Fos水平，減少前額葉神經(jīng)元凋亡有關(guān)，但蒙古黃芪多糖對(duì)ADHD模型大鼠的作用效果不及哌甲酯。