伴隨著科學技術(shù)的飛速發(fā)展和全球人口老齡化的進程加劇，全球醫(yī)療機構(gòu)正在面臨前所未有的診療服務壓力。院內(nèi)感染的有效控制作為提供服務的先決條件，自始至終都是醫(yī)療機構(gòu)日常工作的重中之重[1]。消毒供應中心作為醫(yī)療機構(gòu)中承擔各科室所有重復診療器械、器具和物品清洗、消毒、滅菌以及無菌物品供應的部門，在很大程度上決定著可能由醫(yī)療器械、器具和物品等引發(fā)的院內(nèi)感染幾率高低，是院感控制的關鍵科室，因此，其每一個操作步驟都應該引起院感管理者的充分重視[2]。滅菌作為徹底殺滅器械表面、內(nèi)部等結(jié)構(gòu)中殘留微生物的再處理操作，是消毒供應中心器械無菌儲存與發(fā)放前的最后一個操作步驟，更是保護器械再處理質(zhì)量的最后一道“屏障”。我國衛(wèi)生行業(yè)標準《WS 310.3-2016 醫(yī)院消毒供應中心 第3部分：清洗消毒及滅菌效果監(jiān)測標準》[3]提出，針對器械滅菌，應按照不同滅菌方式所要求的監(jiān)測頻率，進行滅菌效果的生物監(jiān)測，生物監(jiān)測結(jié)果不合格時，對應滅菌器械不予放行。目前，醫(yī)療機構(gòu)所使用的生物監(jiān)測方式，按照監(jiān)測時間、判讀原理等原則區(qū)分，存在著慢速和快速生物監(jiān)測兩種類型，其在得到廣泛使用的同時，對應的可靠性問題引起了業(yè)內(nèi)的普遍關注，其可以直接影響到醫(yī)療機構(gòu)器械再處理的效率和院感控制的風險。文章對該領域進展綜述如下。

1 慢速與快速生物監(jiān)測的發(fā)展

1881年，德國醫(yī)學家Koch[4]首先針對引發(fā)炭疽熱感染的、對滅菌條件產(chǎn)生較強抗力的細菌芽孢進行研究，其提出天然土壤中的芽孢相較炭疽桿菌適宜培養(yǎng)基中產(chǎn)生的芽孢對于滅菌條件有更強的抗力，自此，相關科學家逐漸形成共識：如果一種滅菌方式能夠殺滅抗力最強的細菌形式，可以認為其能夠殺滅其他的生命體形式，此即為生物監(jiān)測的設計理論基礎。經(jīng)過長時間的發(fā)展，1957年，全球首個商業(yè)化的生物指示物問世并被應用于醫(yī)療機構(gòu)[5]。首先推廣使用的是第一代生物監(jiān)測產(chǎn)品，其對應的生物指示物將已接種的菌片置于包裝中，隨后統(tǒng)一放入滅菌設備中進行滅菌，在無菌條件下實現(xiàn)生物指示物的取出和培養(yǎng)，時間需要7 d，以培養(yǎng)基的渾濁狀態(tài)為滅菌結(jié)果的判定標準。

第二代生物監(jiān)測產(chǎn)品，其設計采用自含式包裝方法，將已接種的菌片和培養(yǎng)基同時封裝于一個初級包裝中，在滅菌之前兩者互不接觸，滅菌后不需無菌條件操作，培養(yǎng)時間通常為1～7 d，以培養(yǎng)基顏色變化為滅菌結(jié)果的判定標準，由于培養(yǎng)時間仍需要1 d以上，因此其被認為是普遍意義上的慢速生物監(jiān)測。第三代生物監(jiān)測產(chǎn)品，其包裝方法與第二代產(chǎn)品相同，通過培養(yǎng)基體系中非熒光化合物的添加，實現(xiàn)培養(yǎng)時間的縮短，通常在數(shù)小時甚至1 h內(nèi)，以機器判讀的熒光反饋結(jié)果為滅菌結(jié)果的判定標準，由于可以實現(xiàn)極高的判讀效率，其被認為是普遍意義上的快速生物監(jiān)測。

第一代生物監(jiān)測產(chǎn)品由于需要為期7 d的微生物培養(yǎng)，無法滿足目前醫(yī)療機構(gòu)器械使用快速周轉(zhuǎn)的需求，在一線消毒供應中心中已停止使用。慢速生物監(jiān)測產(chǎn)品能夠在很大程度上縮短微生物培養(yǎng)時間，同時判讀方式比較簡單直接。因此，其在醫(yī)療機構(gòu)中得到了長期廣泛使用?？焖偕锉O(jiān)測產(chǎn)品在判讀時間上真正幫助醫(yī)療機構(gòu)實現(xiàn)了快速的滅菌周轉(zhuǎn)和有據(jù)放行，目前正在整個行業(yè)內(nèi)逐步替代慢速的生物指示物。

2 慢速與快速生物監(jiān)測判讀原理及驗證要求

慢速生物監(jiān)測以自含式生物指示物內(nèi)培養(yǎng)體系中的酸性物質(zhì)為考察對象，如果其含量達到一定濃度，可以使預先存在于液體培養(yǎng)基中的酸堿指示劑發(fā)生視覺上可以觀察到的顏色變化，進而指示滅菌結(jié)果。酸性物質(zhì)為細菌整個生長周期中主要的代謝產(chǎn)物，不同細菌根據(jù)產(chǎn)酶種類的不同，對培養(yǎng)基中主要的糖類或醇類供能物質(zhì)進行針對性發(fā)酵，用于自身供能，同時產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，部分細菌同時會產(chǎn)生氣體代謝物?？焖偕锉O(jiān)測以自含式生物指示物內(nèi)熒光物質(zhì)為考察對象，首先使用特定外置光源對自含式生物指示物細菌培養(yǎng)區(qū)域進行激發(fā)，熒光物質(zhì)受激發(fā)后發(fā)出的熒光可以被熒光接收器捕捉，進而通過機器后臺計算指示滅菌結(jié)果。熒光物質(zhì)由培養(yǎng)體系中非熒光底物轉(zhuǎn)化生成，而根據(jù)相關研究[6-9]，目前非熒光底物的轉(zhuǎn)化主要通過微生物糖類代謝中的重要物質(zhì)α-葡萄糖苷酶或β-磷酸葡萄糖苷酶實現(xiàn)。

美國FDA在《Guidancefor Industryand FDA staff：Biological Indicator（BI）Premarket Notification [510（k）] Submissions》中提出，“通常情況下，F(xiàn)DA推薦7 d作為生物指示物指示滅菌程序的傳統(tǒng)培養(yǎng)時間”“一個生物指示物的培養(yǎng)時間可以少于傳統(tǒng)的7 d甚至更長的培養(yǎng)時間，前提是根據(jù)合適的方法驗證出的縮短后的培養(yǎng)時間對于判定滅菌過程有效性是充分的”[10]。在該指南中，F(xiàn)DA推薦了相關的方法以及最低的批次陽性率一致性要求。Laszlo等[10]對FDA推薦的驗證方法進行了詳細的分析闡述，其認為FDA使用的“Most Probable Number”假設方法（MPN法）是具有統(tǒng)計學依據(jù)的，其規(guī)定的97%及以上的批次一致性能夠很好地保證指示效果。我國衛(wèi)生行業(yè)標準《WS628-2018 消毒產(chǎn)品衛(wèi)生安全評價技術(shù)要求》中，生物指示物的必檢項目中并未包含指示結(jié)果一致性對比。但從實際情況來看，目前我國行業(yè)內(nèi)生物指示物的安評報告中均已加入了縮短后的培養(yǎng)時間和7 d培養(yǎng)結(jié)果的一致性對比。

3 慢速與快速生物監(jiān)測應用爭議

目前，行業(yè)內(nèi)對于慢速生物監(jiān)測的判讀原理及指示結(jié)果的認可度較高。以常見的壓力蒸汽滅菌生物指示物為例進行分析，根據(jù)相關研究，其選用嗜熱脂肪芽孢桿菌作為標的微生物，該菌種在代謝過程中中產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。該體系中，培養(yǎng)基通常選用pH值為7.2的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基[11]。溴甲酚紫作為常見的酸堿指示劑，其指示條件為pH值＞6.8時顯示紫色，pH值＜5.2時顯示黃色[12]。對于自含式生物指示物，由于其可以在一定程度上做到有效的污染物屏蔽，因此可以確信培養(yǎng)體系pH值的大幅降低是細菌生長過程中產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物造成的結(jié)果。

同時，行業(yè)內(nèi)對于快速生物監(jiān)測的應用存在爭議，問題的焦點主要集中于和判讀原理相關的幾個方面。

3.1 特種酶和芽孢生理活動的對應關系

以壓力蒸汽滅菌生物指示物所用嗜熱脂肪芽孢桿菌為例，其產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶用于非熒光底物糖苷鍵的切斷。α-葡萄糖苷酶對于微生物的糖類代謝具有重要作用，其在幾乎所有的生命體內(nèi)均廣泛存在，在成熟細胞中含量較高[13]。Mphahlele等[14]通過研究表明微生物產(chǎn)生的α-葡萄糖苷酶可以分為胞內(nèi)酶、細胞結(jié)合酶和胞外酶3種類型。根據(jù)考慮到自含式生物指示物菌片負載芽孢的制備工藝，在產(chǎn)品使用之前，載體菌片上很有可能是同時含有以上3種類型。

Peytam等[15]對于α-葡萄糖苷酶的活性進行了深入研究，其發(fā)現(xiàn)胞外酶會在98℃、30 min的熱激活條件下?lián)p失絕大部分的活性，考慮到目前一線臨床使用的滅菌器程序，可以認為經(jīng)歷完整滅菌程序的載體菌片上胞外酶已完全失去活性，同時，其發(fā)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶同時存在于位于不同生理周期的芽孢的外層芽孢被、內(nèi)層芽孢被和芽孢核中，如果胞外酶已經(jīng)完全失去活性，則芽孢必須向胞內(nèi)攝取糖類底物才能發(fā)揮α-葡萄糖苷酶的水解特性。Hussain等[16]通過免疫電鏡觀察到對于休眠狀態(tài)下的嗜熱脂肪桿菌芽孢，α-葡萄糖苷酶主要位于芽孢原生質(zhì)外的芽孢被中。Laaroussi等[17]研究顯示α-葡萄糖苷酶的最適溫度為80℃以下，因此在真實的滅菌條件下，假設芽孢的整個細胞結(jié)構(gòu)，包括含有遺傳物質(zhì)的芽孢核、芽孢皮、芽孢內(nèi)外胞被統(tǒng)一破壞，則α-葡萄糖苷酶也會因為失去結(jié)構(gòu)保護而快速失活；假設芽孢的部分結(jié)構(gòu)被破壞，此時芽孢殘留完整結(jié)構(gòu)中的α-葡萄糖苷酶依然有可能發(fā)揮催化作用。

3.2 慢速和快速生物監(jiān)測指示結(jié)果一致性

結(jié)合微生物培養(yǎng)時間相關文獻研究及中美不同地區(qū)實際要求[15-19]，可以認為無論是慢速生物指示物還是快速生物指示物，其對應培養(yǎng)時間均非權(quán)威認定的時間標準，在生物指示物上市前，均有必要進行一致性驗證試驗。吳千惠等[5]的研究顯示，402次快速生物監(jiān)測與慢速生物監(jiān)測結(jié)果具有高度一致性，且快速生物監(jiān)測能夠顯著提升監(jiān)測速度，降低監(jiān)測成本。但也有研究報道，慢速和快速生物監(jiān)測指示結(jié)果出現(xiàn)不一致是被接受的情況[20-21]。

對于慢速生物監(jiān)測，指示物的變色需要依托以下兩個過程：（1）存活芽孢在合適的生長環(huán)境下，進行活化、出芽、生長和繁殖等一系列生理活動，向環(huán)境中分泌大量的酸性代謝產(chǎn)物；（2）足量的酸性代謝產(chǎn)物引起的pH變化足夠跨越顯色劑的變色區(qū)間。對于快速生物指示物，閱讀機器通過預先的程序設定，對于早期的熒光捕捉具有高度敏感性，此時體系中對應的芽孢數(shù)量較少，生理周期也處于早期階段。

慢速和快速生物監(jiān)測結(jié)果不一致的情況，往往表現(xiàn)為慢速指示結(jié)果陰性、快速指示結(jié)果陽性的情況。針對此類情況，第一種可能性是滅菌過程有效性處于臨界狀態(tài)，體系中殘留的、具有活性的芽孢數(shù)量極少，其無法通過規(guī)定時間內(nèi)的培養(yǎng)達到足以使慢速生物指示物變色的微生物數(shù)量[22]；第二種可能性是體系內(nèi)有少量殘留芽孢且其部分結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，同時還有殘留α-葡萄糖苷酶或芽孢依然在合成α-葡萄糖苷酶；第三種可能性是體系內(nèi)所有芽孢已經(jīng)滅活，全部結(jié)構(gòu)被破壞，同時還有殘留α-葡萄糖苷酶[23]。通過前述分析，第三種可能性發(fā)生概率極低，滅菌的整個過程必須經(jīng)過非常精細的條件設計和真實呈現(xiàn)才會形成此類情況。

3.3 陽性判讀結(jié)果的認知

劉晨鳴等[24]的研究分析，對于慢速生物監(jiān)測，當有陽性監(jiān)測結(jié)果呈現(xiàn)時，體系內(nèi)同時已經(jīng)含有大量的處于對數(shù)期、穩(wěn)定期的細菌，提示對應滅菌過程不能提供所要求的滅菌保障水平。而對于快速生物監(jiān)測，首先，其監(jiān)測結(jié)果已經(jīng)按照不同要求與7 d培養(yǎng)結(jié)果進行一致性的對比，雖然其可能同慢速監(jiān)測結(jié)果不符，但理論上應該以7 d監(jiān)測結(jié)果的對比數(shù)據(jù)為準[25]。其次，雖然其可能在后續(xù)的慢速培養(yǎng)中顯示陰性結(jié)果并提示芽孢無法完成正常的細菌生理周期，但指示標準菌種的殘留已提示出器械可能表面微生物殘留，其是否能在人體環(huán)境下完成生理周期并顯示致病性應該引起重視。最后，有條件的醫(yī)療機構(gòu)應該通過相應的檢驗方法確定指示物中芽孢的殘留情況和生理狀態(tài)。

4 快速生物指示物的應用現(xiàn)狀

自快速生物指示物問世以來，許多醫(yī)療機構(gòu)都將其應用于日常滅菌監(jiān)測及科學研究當中。蔡海燕[26]通過為期6個月的試驗對比，證實快速生物指示物能夠明顯縮短器械周轉(zhuǎn)時間和生物監(jiān)測陽性召回工作量，而不同型號的生物監(jiān)測產(chǎn)品無統(tǒng)計學意義上的陽性率差異；尹翔宇等[27]通過分析科室生物監(jiān)測失敗的原因，認為快速生物監(jiān)測能夠給臨床帶來極大便利，但需要通過嚴格規(guī)范操作來確保得出準確的監(jiān)測結(jié)果，避免“假陽性”事件的發(fā)生；馬仕洪等[28]通過對比試驗發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的菌片式生物指示物容易受到污染物影響，而其他多個品牌的慢速及快速生物指示物能夠避免“假陽性”結(jié)果的產(chǎn)生，且指示結(jié)果之間沒有明顯差異。萬莉等[29]在對快速生物指示物的應用過程當中，給予了其高度評價，該團隊認為可能的“假陽性”結(jié)果和滅菌器的性能有密切關系。

5 小結(jié)

綜合分析相關國內(nèi)外研究文獻，慢速與快速生物監(jiān)測均具備相當?shù)那液侠淼睦碚摶A，且正在被國內(nèi)外醫(yī)療機構(gòu)廣泛應用于日常工作和科學研究當中，為相關單位提升器械再處理水平、提高器械再處理質(zhì)量和降低院感事件發(fā)生率做出了相應的貢獻，應當針對其使用價值給予肯定。與此同時，行業(yè)內(nèi)出現(xiàn)的應用爭議主要在于困擾一線臨床使用者的監(jiān)測結(jié)果準確性問題，慢速與快速生物指示物的監(jiān)測結(jié)果同微生物殘留水平的對應關系還無法做到實時驗證，如何規(guī)范檢測水平、開發(fā)實時微生物檢測技術(shù)也是下個階段需要研究人員深入探索的問題。