張雪莉，丁艷華，馬海樂*，洪 晨，張 濤，唐艷萍

（1 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江212013 2 湖南新金浩茶油股份有限公司 湖南永州 426100）

油茶籽粕中營養(yǎng)成分豐富，主要含有多糖40%、茶皂素10%～15%、粗蛋白15%、粗脂肪5%以及多種氨基酸，是一種潛在價值很高的飼料原料[1]。茶皂素因溶血作用[2]，而可廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物害蟲防治，且無污染、無毒害，耐于儲存。茶皂素還是一種性能良好的天然非離子表面活性劑[3]，可廣泛應(yīng)用于日用化工、紡織和食品等行業(yè)[4-5]。此外，茶皂素具有殺菌[6]、消炎抗?jié)B[7]以及抗氧化[8]等生物活性。從油茶籽餅粕中提取茶皂素對于提高油茶籽餅粕的經(jīng)濟價值，充分利用油茶籽餅粕資源，具有著重要的現(xiàn)實意義，應(yīng)用前景十分廣闊。

目前，茶皂素含量常用香草醛-濃硫酸顯色法測定[9]，也有重量法、色譜法等[10-11]。蛋白質(zhì)含量檢測方法較多，主要有凱式定氮法、lowry 法和杜馬斯燃燒法等[12-13]。檢測多糖的方法多為苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法[14-15]。這些傳統(tǒng)檢測方法過程繁瑣、耗時較長、污染環(huán)境，且實際測量的化學(xué)值與提取過程之間存在延遲或誤差，迫切需要一種連續(xù)、快速、準(zhǔn)確、環(huán)保的方法監(jiān)測提取過程中的茶皂素質(zhì)量濃度、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和多糖質(zhì)量濃度的變化，以確定提取終點。

相較于傳統(tǒng)分析技術(shù)，近紅外光譜技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、成本低和綠色環(huán)保等特點[16-17]。Hua等[18]對茯苓多糖的提取過程進行近紅外光譜監(jiān)測；Tian 等[19]利用近紅外光譜和化學(xué)計量學(xué)技術(shù)聯(lián)合的方法測定全麥粉中的總酚含量。此外，近紅外光譜技術(shù)也被用于藏紅花[20]和牛肉[21]的鑒別和摻假檢測?？梢?，近紅外光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于在線和現(xiàn)場監(jiān)測[22-23]。

本研究應(yīng)用便攜式近紅外光譜技術(shù)，實時監(jiān)測茶皂素提取過程中的主要質(zhì)量參數(shù)變化，研究其適用性并選擇一種有效的算法建立穩(wěn)健的預(yù)測模型，實現(xiàn)提取過程中對各質(zhì)量參數(shù)的預(yù)測，為終點的判斷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶籽餅粕，湖南新金浩茶油股份有限公司；茶皂素標(biāo)品，北京索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白，上海麥克林生化科技有限公司；香蘭素、乙醇和濃硫酸等試劑均為分析純級。

T-6 新世紀(jì)可見分光光度計，北京普析儀器有限公司；NIRQUEST256-2.5 近紅外光譜儀、TP300 浸入式光纖探頭、DH-2000-BAL UV-VISNIR 光源，美國海洋光學(xué)公司；臺式高速冷凍離心機，鹽城市凱特實驗儀器有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取過程中原位實時光譜采集 近紅外原位在線監(jiān)測提取過程的系統(tǒng)裝置圖如圖1 所示。75%乙醇以料液比1∶10 在60 ℃下提取，每2 min取樣一次，共計88 個樣品。將所有樣品離心（10 000 r/min 離心10 min），收集上清液，放置于-20 ℃保存，待測化學(xué)值。光譜采集參數(shù)：光譜范圍為900～2 500 nm，分辨率為6.4 nm，掃描8 次，光程4 mm。以75%乙醇（60 ℃）作為背景，每個樣品重復(fù)采集3 次，取其平均值作原始光譜圖。

圖1 原位實時光譜在線監(jiān)測茶皂素提取過程裝置圖Fig.1 Device diagram for in-situ real-time spectroscopy on-line monitoring of tea saponin extraction process

1.2.2 茶皂素質(zhì)量濃度、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和多糖質(zhì)量濃度的離線測定 茶皂素質(zhì)量濃度采用香草醛-濃硫酸顯色法測定[24]。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度采用lowry 法[12]測定，以牛血清白蛋白作為基準(zhǔn)物質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用苯酚硫酸法[14]測定多糖質(zhì)量濃度，以干燥的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品作為基準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。提取的茶皂素質(zhì)量濃度、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和多糖質(zhì)量濃度均按下式計算：

c=C×N

式中，c——樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；C——測定質(zhì)量濃度，mg/mL；N——稀釋倍數(shù)。

1.2.3 原位實時光譜預(yù)處理 采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV）、多項式卷積平滑（SG）、一階導(dǎo)數(shù)（1stDer）和二階導(dǎo)數(shù)（2ndDer）4 種常見的預(yù)處理方法對提取過程中采集的原始光譜進行預(yù)處理。采用PLS模型進行預(yù)處理方法的對比研究，選取最優(yōu)的預(yù)處理方法。

1.2.4 提取過程原位實時監(jiān)測定量模型的建立選用Set Partitioning Based On Joint X-Y Distance（SPXY）方法對近紅外光譜儀采集的光譜信息進行校正集（66 個）和預(yù)測集（22 個）樣本的劃分，共計88 個樣本，如表1 所示。

表1 校正集和預(yù)測集中茶皂素、蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度的實測值Table 1 Measured values of tea saponin，protein and polysaccharide mass concentrations in correction and prediction set

采用偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）、區(qū)間偏最小二乘法（Interval partial least squares，ipLS）和聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘法（Synergy interval PLS，Si-PLS）進行模型構(gòu)建，分別篩選出與茶皂素質(zhì)量濃度、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和多糖質(zhì)量濃度相關(guān)度高、預(yù)測及穩(wěn)健性較好的模型。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)處理和分析均在Matlab 2009b中進行。從http：//www.models.kvl.dk/免費下載Si-PLS Matlab 代碼。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取過程中茶皂素質(zhì)量濃度、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和多糖質(zhì)量濃度的變化

提取過程中茶皂素質(zhì)量濃度、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和多糖質(zhì)量濃度變化如圖2 所示，隨著提取時間延長，各樣品質(zhì)量濃度雖不斷增加，但增長緩慢，呈現(xiàn)波動變化?？梢园l(fā)現(xiàn)，提取過程中，茶皂素提取量最高，多糖及蛋白質(zhì)提取量較低，可見此提取方法能較大限度的提取較高純度的茶皂素。同時監(jiān)測茶皂素、蛋白質(zhì)和多糖的質(zhì)量濃度變化，可以更加全面的分析數(shù)據(jù)并建立模型，對提取中主要物質(zhì)的變化進行更好的預(yù)測。

圖2 提取過程中茶皂素、蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度變化Fig.2 Off-line measured data of tea saponin，protein and polysaccharide mass concentration during the extraction process

2.2 提取過程中光譜預(yù)處理

通過近紅外光譜儀采集到茶皂素提取過程中的原始光譜圖，選取標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV）、多項式卷積平滑（SG）、一階求導(dǎo)（1stDer）和二階求導(dǎo)（2ndDer）4 種預(yù)處理方法對原始光譜進行預(yù)處理。4 種預(yù)處理方法結(jié)合最小二乘法（PLS）對提取過程采集的光譜分別與茶皂素質(zhì)量濃度、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和多糖質(zhì)量濃度進行建模，以校正集決定系數(shù)（RC）、交叉校驗殘差均方根誤差（RMSECV）和預(yù)測集決定系數(shù)（Rp）、預(yù)測殘差均方根誤差（RMSEP）為模型評價指標(biāo)，比較其建模效果從而篩選出最優(yōu)的預(yù)處理方法，結(jié)果見表2。由表2 可知，在已構(gòu)建的光譜信息和茶皂素質(zhì)量濃度之間的模型中，1stDer 預(yù)處理方法建立的校正模型、預(yù)測模型的決定系數(shù)RC值、Rp值均最大，分別為0.9819 和0.9932，且RMSECV 值、RMSEP 值比較低，分別為1.67 和1.08。在光譜信息和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度之間的模型中，1stDer 預(yù)處理方法建立的校正模型、預(yù)測模型的決定系數(shù)RC值、Rp值分別為0.9718 和0.9879，而RMSECV 值、RMSEP 值也較低，分別為0.518 和0.323。已構(gòu)建的光譜信息和多糖質(zhì)量濃度之間的模型中，1stDer 預(yù)處理方法建立的校正模型、預(yù)測模型的決定系數(shù)RC值、Rp值也最大，分別為0.9798 和0.9947，RMSECV 值、RMSEP 值較低，分別為0.531 和0.309。因此，與其它3 種預(yù)處理方法相比，使用1stDer 預(yù)處理方法對原始光譜進行預(yù)處理后，得到的模型預(yù)測能力較強、穩(wěn)健性好。因此，本研究后續(xù)將采用1stDer 預(yù)處理后的光譜開展模型的構(gòu)建。

表2 不同方法預(yù)處理近紅外光譜的結(jié)果Table 2 Results of near-infrared spectroscopy by different pretreatment methods

2.3 近紅外光譜與提取過程的建模研究

2.3.1 茶皂素質(zhì)量濃度的Si-PLS 模型 表3 為提取過程中茶皂素的Si-PLS 模型結(jié)果。從表中可看出，將光譜劃分為16 個區(qū)間，并聯(lián)合其中的4個子區(qū)間[2，3，7，14] 時可得到最優(yōu)的Si-PLS 模型，所對應(yīng)的光譜區(qū)間分別為999.07～1 096.61，1 103.10～1 200.36，1 516.35～1 612.58，2 229.86～2 324.62 nm。999.07～1 096.61 nm 區(qū)間包含1 065 nm 和1 029 nm 處的組合頻吸收譜帶[25]，主要吸收C-H 和O-H 的三級倍頻和二級倍頻[26]。

在最佳聯(lián)合子區(qū)間下，對提取過程中的茶皂素質(zhì)量濃度建立定量分析模型，其校正集及預(yù)測集樣本實測值與預(yù)測值之間的散點圖如圖3a 和圖3b 所示。由圖可知，對提取過程中茶皂素質(zhì)量濃度，校正模型的決定系數(shù)RC值為0.9858，RM SECV 為1.48，預(yù)測模型的決定系數(shù)RP值為0.9889，RMSEP 為1.36。

2.3.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的Si-PLS 模型 從表3可看出，將光譜劃分為16 個區(qū)間，并聯(lián)合其中的4 個子區(qū)間[2，3，7，14]時可得到蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的最優(yōu)的Si-PLS 模型，所對應(yīng)的光譜區(qū)間分別為999.07～1 096.61，1 103.10～1 200.36，1 516.35～1 612.58，2 229.86～2 324.62 nm。其中，包含的1 530～1 600 nm 為NH 一級倍頻吸收譜帶，對蛋白質(zhì)分析非常重要[27]。

表3 提取過程中茶皂素、蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度的Si-PLS 模型優(yōu)選結(jié)果Table 3 Optimization results of Si-PLS model for tea saponin，protein and polysaccharide mass concentration in the extraction process

（續(xù)表3）

在最佳聯(lián)合子區(qū)間下，對提取過程中的蛋白質(zhì)濃度建立定量分析模型，其校正集及預(yù)測集樣本實測值與預(yù)測值之間的散點圖如圖3c 和圖3d所示。由圖可知，對提取過程中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，校正模型的決定系數(shù)RC值為0.9766，RMSECV 為0.472，預(yù)測模型的決定系數(shù)RP值為0.9859，RMSEP 為0.354。

圖3 Si-PLS 模型中茶皂素、蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度實測值與預(yù)測值之間的散點圖Fig.3 Calibration set and prediction set of Si-PLS joint optimal interval model

2.3.3 多糖質(zhì)量濃度的Si-PLS 模型 由表3 可得，將光譜劃分為18 個區(qū)間，并聯(lián)合其中的4 個子區(qū)間[6，7，8，13]時可得到多糖質(zhì)量濃度的最優(yōu)的Si-PLS 模型，所對應(yīng)的光譜區(qū)間分別為1 349.00～1 432.76，1 439.20～1 522.77，1 529.19～1 612.58，1 976.30～2 058.85。其中，1 440 nm 附近通常為游離OH 伸縮振動吸收峰[25]。

在最佳聯(lián)合子區(qū)間下，對提取過程中的多糖質(zhì)量濃度建立定量分析模型，其校正集及預(yù)測集樣本實測值與預(yù)測值之間的散點圖如圖3e 和圖3f 所示。由圖可知，對于提取過程中多糖質(zhì)量濃度，校正模型的決定系數(shù)RC值為0.9841，RM SECV 為0.471，預(yù)測模型的決定系數(shù)RP值為0.9919，RMSEP 為0.359。

2.4 3 種模型的結(jié)果比較

為了確定適合提取過程的定量模型，提高模型的建模效果和預(yù)測性能，將PLS、iPLS 和Si-PLS建立的模型進行了比較，結(jié)果如表4 所示。從表可看出，Si-PLS 模型優(yōu)于其它2 種模型，對于這3 個關(guān)鍵物質(zhì)中的任一個，Si-PLS 模型都能得到較好的預(yù)測結(jié)果，且結(jié)果表明利用所開發(fā)的原位光譜學(xué)系統(tǒng)測量提取過程中的物質(zhì)是可行的。

用經(jīng)典PLS 算法對900～2 500 nm 的全光譜信息（包含256 個變量）的回歸模型進行校正時，提取工藝中存在的許多共線變量或無關(guān)變量（如溫度波動）等冗余信息都會削弱PLS 模型的穩(wěn)健性。從表4 中還可看出，對于提取中茶皂素、蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度的模型建立，iPLS 模型甚至比PLS 模型更差。原因可能是iPLS 建模時只有一個子區(qū)間，許多數(shù)據(jù)并沒有得到充分應(yīng)用，從而使校正模型和預(yù)測模型都不理想[28]。相較于PLS 和i-PLS，Si-PLS 建模效果最優(yōu)。因為Si-PLS 模型是在同一次的區(qū)間劃分下，聯(lián)合了精度較高的幾個光譜子區(qū)間建立的PLS 模型[29]。與PLS 和iPLS 相比，Si-PLS 能更好的捕獲利用信息，較好的監(jiān)測提取過程中的茶皂素濃度、蛋白質(zhì)濃度和多糖濃度。

表4 茶皂素、蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度最佳模型篩選結(jié)果Table 4 Screening results of optimal model for tea saponin，protein and polysaccharide mass concentration

3 結(jié)論

本研究表明，近紅外光譜技術(shù)在測定茶皂素提取過程中的3 個重要的質(zhì)量參數(shù)——茶皂素質(zhì)量濃度、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和多糖質(zhì)量濃度方面具有很大潛力。在對樣品無損的前提下，能快速準(zhǔn)確的測定提取過程中的物質(zhì)變化，以判斷提取終點。在建立預(yù)測模型時，Si-PLS 與傳統(tǒng)的PLS 和iPLS校正方法相比，能剔除大量冗余信息，篩選出精度較高的光譜區(qū)間，具有很大的優(yōu)越性。采用近紅外光譜技術(shù)聯(lián)合化學(xué)計量學(xué)方法對茶皂素提取過程進行實時、原位檢測，可顯著提高提取的質(zhì)量控制效率和質(zhì)量保證。