趙 倩，查文良

(1.湖北科技學院醫(yī)學部藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院附屬第二醫(yī)院)

多種原因可導致男性睪丸損傷，如接觸有毒物質(zhì)、疾病所觸發(fā)的并發(fā)癥等。鐵死亡是鐵依賴的，以細胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧(reactive oxygen species,ROS)堆積為特征的細胞死亡形式。睪丸損傷時會出現(xiàn)類似鐵死亡的表現(xiàn)，如鐵代謝紊亂、ROS增加等。本文擬對鐵死亡在睪丸損傷中的作用及機制進行綜述。

1 鐵死亡概述

鐵死亡是一種由致命的脂質(zhì)過氧化引起的細胞死亡形式，其所觸發(fā)的細胞死亡可被鐵螯合劑(如去鐵胺)、親脂型抗氧劑、脂質(zhì)過氧化抑制劑(liproxstatin-1)和多不飽和脂肪酸的消耗所抑制[1]。

盡管初步研究表明，鐵死亡在形態(tài)、生化和遺傳上都不同于凋亡、壞死和自噬[2]，但大多數(shù)研究者認為發(fā)生鐵死亡的細胞通常表現(xiàn)為壞死樣的形態(tài)學改變[3]。鐵死亡可表現(xiàn)為鐵離子水平的異常、線粒體膜致密、線粒體嵴減少或消失、線粒體外膜破裂、細胞核大小正常，但染色質(zhì)缺乏凝集[4]。

鐵死亡主要受谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)和半胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)Xc(System Xc)兩個核心因子的調(diào)控。具體調(diào)節(jié)機制如下：①GPX4作為一種磷脂氫過氧化物酶，將高毒性磷脂過氧化物(AA/AdA-PE-OOH)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳臒o毒性的磷脂醇(PLOH)。GPX4的表達活性由硒和谷胱甘肽(GSH)控制[5]。②System Xc：其是由輕鏈溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)與重鏈溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2)組成的異二聚體，調(diào)控胱氨酸與谷氨酸的互換，其被阻斷時，可出現(xiàn)谷胱甘肽合成減少、氧化應激增加、脂質(zhì)過氧化增加，進而誘導細胞死亡[6]。

目前，鐵死亡的相關(guān)機制仍未完全闡明，但其在各種疾病中被廣泛研究。如帕金森、心力衰竭、急性腎損傷等[7-9]。同時，鐵死亡與生殖系統(tǒng)損傷的研究近幾年也層出不窮，所以干預鐵死亡可能成為防治生殖系統(tǒng)損傷的新措施。

2 鐵死亡與睪丸損傷

在各種因素的刺激之下，不論是毒性物質(zhì)的暴露(如亞砷酸鈉)[10]，或是疾病帶來的長期內(nèi)環(huán)境的紊亂(如糖尿病)，均可引起睪丸組織功能和結(jié)構(gòu)的異常。表現(xiàn)為睪丸的組織學改變?nèi)绮G丸的帽狀組織，體和尾狀區(qū)域的質(zhì)量減少、立體纖毛減少、上皮細胞聚集等；也可表現(xiàn)為睪丸功能水平的異常如神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)紊亂、生精及射精功能障礙等[11]。近年來，鐵死亡在生殖系統(tǒng)中的作用也引起了學者們的廣泛關(guān)注。關(guān)鍵性因子GPX4在精子發(fā)生等過程起重要作用，這提示鐵死亡在睪丸損傷中可能扮演重要角色。

2.1 影響鐵代謝

細胞內(nèi)存在鐵穩(wěn)態(tài)，鐵離子的調(diào)節(jié)對鐵死亡影響深遠。肝臟合成的鐵調(diào)素直接調(diào)控血清鐵的水平，而細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)主要依靠鐵調(diào)控蛋白系統(tǒng)。體內(nèi)Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tfrc)結(jié)合，通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TFR1)介導進入內(nèi)核，F(xiàn)e3+被STEAP3亞鐵還原酶還原為Fe2+。最后經(jīng)二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1(DMT1，也稱SLC11A2)將Fe2+釋放進入不穩(wěn)定的鐵池中，多余的鐵儲存在鐵蛋白中。鐵蛋白是一種由鐵蛋白輕鏈多肽(FTL)與鐵蛋白重鏈1(FTH1)構(gòu)成的復合物。此外，膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Fpn)是鐵調(diào)素的受體，可以調(diào)控鐵向細胞外釋放[4]，部分Fe2+再經(jīng)過氧化變成Fe3+繼續(xù)體內(nèi)鐵循環(huán)。

睪丸缺血再灌注(I/R)損傷可誘導生殖細胞和支持細胞的死亡，相對的抑制細胞死亡可改善急性睪丸I/R損傷。通過構(gòu)建氧糖剝奪/再灌注組(OGD/R)細胞模型，與正常的Sertoli細胞對比，研究發(fā)現(xiàn)該模型導致的睪丸缺血再灌注損傷可能通過降低Fpn的表達而減少鐵的輸出從而誘導鐵死亡的發(fā)生，但在Tfrc、TFR1、DMT1、儲鐵蛋白未觀察到表達差異性，表明缺血再灌注損傷通過減少鐵的降解，并未改變鐵的攝入而誘導鐵死亡[12]。男性吸煙患者精漿中亦可見鐵水平異常，細胞呈現(xiàn)鐵死亡特征[13]。在暴露于化療藥物白消安的小鼠與應用Ferrostatin-1(Fer-1)，DFO(去鐵胺)組相比，F(xiàn)er-1、DFO組使得FPN1明顯上調(diào)，TFR1表達下降，DMT1無表達差異性，說明在其損傷中通過影響FPN的表達來抑制鐵死亡[14]。暴露于亞砷酸鹽的小鼠中可見亞砷酸鹽以相對劑量依賴性的方式顯著提高了總鐵和Fe2+的濃度，Tfrc、SLC11A、FTH1表達均有增加[10]。

2.2 影響脂質(zhì)過氧化

鐵死亡需要脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生，與多種過程相關(guān)，包括NADPH(還原型輔酶Ⅱ)介導的脂質(zhì)過氧化、Fenton反應產(chǎn)生的鐵依賴性ROS和GSH的耗竭。脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的重要環(huán)節(jié)。

2.2.1 GPX4失活

GPX4在精子形成過程中起著重要作用。GPx4有三種類型：mGPx4主要轉(zhuǎn)運至線粒體、nGPx4主要定位于核仁、cGPx4主要分布于細胞質(zhì)和細胞核。研究發(fā)現(xiàn)，睪丸組織中mGPX4 mRNA和nGPX4 mRNA的表達明顯高于其他組織[14]。尤其是精子發(fā)生期間，睪丸中mGPx4 mRNA和nGPx4 mRNA的表達顯著，誘導實驗中mGPX4 KO小鼠由于線粒體結(jié)構(gòu)損傷而表現(xiàn)出雄性不育，但睪丸中精子數(shù)量正常。mGPx4與nGPx4起始密碼子突變轉(zhuǎn)基因可以挽救所有GPx4 KO小鼠的胚胎致死率，而cGPx4起始密碼子突變轉(zhuǎn)基因不能挽救胚胎致死率，證實其對小鼠胚胎發(fā)育和正常生長至關(guān)重要。所有GPx4 KO小鼠的精母細胞均表現(xiàn)出睪丸中生精細胞的嚴重缺陷，精子數(shù)量明顯降低，鞭毛和精子線粒體結(jié)構(gòu)異常，導致不育。所有GPx4 KO小鼠給予維生素E治療可挽救小鼠精子發(fā)生的缺陷，從而恢復精子數(shù)量[15]。

另有研究發(fā)現(xiàn)吸煙會影響男性精液的質(zhì)量，應用GC-2細胞株暴露于香煙凝霧冷凝物(CSC)中進行造模，并與正常GC-2組、GC-2+CSC+Fer-1組、GC-2+CSC+Z-VAD-FMK組進行對比，觀察到，GSH與GPX4在CSC處理24h后顯著降低并在Fer-1處理的細胞株中升高，提示吸煙與精漿中高水平的鐵死亡有關(guān)，并影響經(jīng)精子質(zhì)量[16]。

2.2.2 System XC

System XC-：其由輕鏈溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)與重鏈溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2)組成的異二聚體，影響GSH的含量，進而影響脂質(zhì)過氧化。研究發(fā)現(xiàn)[10]，亞砷酸鹽誘導的小鼠睪丸氧化損傷主要來自線粒體脂質(zhì)過氧化，細胞水平(GC-2)表現(xiàn)出鐵死亡現(xiàn)象，經(jīng)過亞砷酸鹽處理后，導致睪丸中的SLC7A11蛋白表達下降，GSH耗盡，影響GPX4活性，觸發(fā)鐵死亡。同時，在p533KR/3KRXRCC4-/-小鼠的脾臟和睪丸中亦可見SLC7A11 被下調(diào)[17]。

2.2.3 Nrf2

核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)在鐵死亡中被證實起關(guān)鍵調(diào)控作用。Nrf2可以操控下游抗氧化基因(GPX4、血紅加壓素酶1等)，調(diào)節(jié)細胞死亡。

實驗[13]將小鼠分成4組：正常組、白消安暴露組、白消安+Fer-1組、白消安+DFO組，觀察到其 GPX4、Nrf2水平明顯異常，經(jīng)鐵死亡抑制劑處理后恢復至正常水平，精子活力及精子濃度明顯升高，對其形態(tài)學表現(xiàn)如小鼠附睪精子形態(tài)亦有改善作用。證實白消安通過下調(diào)Nrf2表達，從而導致GPX4表達下降，誘發(fā)鐵死亡。

2.2.4 脂氧合酶催化多種不飽和脂肪酸

脂氧合酶催化多種不飽和脂肪酸(PUFAs)的氧化和降解，由于其在多種疾病中的作用而備受關(guān)注，如缺血性心肌病、糖尿病、慢性髓系白血病等都與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物4(4HNE)的升高密切相關(guān)。4HNE來源于組織和細胞中ω-6多不飽和脂肪酸(PUFAs)的脂質(zhì)過氧化過程，其細胞毒性很大程度上依賴于其共價修飾，4HNE修飾會導致男性生殖細胞中蛋白穩(wěn)態(tài)的嚴重變化，受精卵識別所需的關(guān)鍵蛋白急劇丟失[18]。

我們觀察到在圓形精子細胞階段是生殖細胞成熟的一個臨界點，這個階段細胞變得非常容易受到脂質(zhì)過氧化、4HNE的產(chǎn)生以及相關(guān)4HNE修飾蛋白靶點(如熱休克蛋白A2)相關(guān)不穩(wěn)定性因素影響的關(guān)鍵點[19]，且對鐵死亡具有獨特的敏感性。在成熟的人類精子中，花生四烯酸-15-脂加氧酶(ALOX15)的抑制可阻止4HNE誘導的蛋白修飾也可改善精子功能和精卵相互作用。同時，在其他實驗中運用RSL3等抑制劑觀察GPX4等蛋白的變化，證實ALOX15可以誘導鐵死亡[20]。

2.2.5 P53

P53在腫瘤發(fā)展、基因組完整性和正常細胞衰老過程中扮演重要角色。運用基因敲除小鼠實驗發(fā)現(xiàn)[17]，p533KR/3KRXRCC4-/-表型小鼠出現(xiàn)衰老相關(guān)變化，男性生殖系統(tǒng)中的衰老主要表現(xiàn)在睪丸中觀察到睪丸質(zhì)量顯著降低，廣泛的生精上皮細胞變性。其途徑描述為P53激活，致使SLC7A11表達下降，半胱氨酸攝取減少，GSH下降，同時伴隨PTGS2(潛在鐵死亡標志物)水平升高，致使鐵死亡的發(fā)生，進而損傷睪丸。

2.2.6 其他因子

諸多其他因子也可以影響脂質(zhì)過氧化的水平，如VDAC、CARS等，其中VDAC的研究與睪丸損傷聯(lián)系最為密切。VDAC也稱為線粒體孔蛋白，是在線粒體外膜中鑒定出的能夠形成親水孔結(jié)構(gòu)的一組蛋白質(zhì)。VDAC允許代謝物穿過線粒體外膜，并參與代謝物的運輸和信號轉(zhuǎn)導，其有三種同工型：VDAC1、VDAC2、VDAC3。VDAC的開放允許呼吸鏈底物、ADP、磷酸等進入線粒體。VDAC內(nèi)含微管蛋白調(diào)節(jié)其開放，阻塞VDAC可以限制上述物質(zhì)流入線粒體及ATP的產(chǎn)生，鐵死亡可以抑制其阻塞作用，促進其開放，提高ADP/ATP的比值與氧化應激水平。運用熒光定位等技術(shù)發(fā)現(xiàn)：VDAC1主要位于Sertoli細胞中，VDAC2位于晚期精母細胞和精子細胞中，VDAC3位于睪丸所有細胞類型中，特別是在睪丸間質(zhì)細胞中[21]。在亞砷酸鹽處理的GC-2細胞誘發(fā)鐵死亡中也觀察到VDAC3表達含量的上升[10]。

2.3 MAPK

目前已有文獻[12]報道證實MAPK信號路徑可以誘發(fā)鐵死亡，主要有以下3個蛋白即ERK、P38和JNK。在OGD/R睪丸支持細胞模型中對上述3種因子均進行通路分析發(fā)現(xiàn)，其不能促進JNK和ERK1/2的磷酸化，但NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)顯著抑制了OGD/R誘導的P38 MAPK磷酸化，即其通過P38-MAPK路徑觸發(fā)鐵死亡。

3 展 望

鐵死亡主要包括兩個關(guān)鍵因子即GPX4與System Xc，鐵死亡相關(guān)因子與睪丸損傷密切相關(guān)，隨著進一步深入的探究，干預鐵死亡，可為治療睪丸損傷及雄性不育提供理論基礎。