張成鵬

（河南省科研平臺(tái)服務(wù)中心，鄭州 450000）

單細(xì)胞測(cè)序（Single Cell Sequencing，SCS）技術(shù)是指單細(xì)胞基因組或轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序，從而獲得基因組、轉(zhuǎn)錄組或其他多細(xì)胞信息，以揭示細(xì)胞種群差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系. 通過對(duì)單個(gè)細(xì)胞的全基因組、轉(zhuǎn)錄基因組和表觀基因組進(jìn)行測(cè)序，可以揭示疾病發(fā)生和進(jìn)展所涉及的復(fù)雜異質(zhì)機(jī)制，進(jìn)一步改善疾病診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)和藥物治療效果的監(jiān)測(cè). 傳統(tǒng)的測(cè)序方法只能得到許多細(xì)胞的平均值，無法分析少量細(xì)胞并丟失細(xì)胞異質(zhì)性信息. 與之相比，單細(xì)胞技術(shù)可以檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞間異質(zhì)性、區(qū)分少量細(xì)胞和繪制細(xì)胞圖. 然而，早期的單細(xì)胞測(cè)序由于成本高而限制了其廣泛使用，但隨著研究的不斷發(fā)展，許多新的單細(xì)胞測(cè)序方法被開發(fā)出來，降低了單細(xì)胞測(cè)序的成本閾值. 目前，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)越來越多地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域.

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

SCS技術(shù)旨在通過下一代測(cè)序識(shí)別單個(gè)細(xì)胞的基因組序列信息，并獲取細(xì)胞之間遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)差異的信息，從而更好地了解單個(gè)細(xì)胞在微環(huán)境中的功能. SCS主要涉及以下四個(gè)步驟：?jiǎn)渭?xì)胞分離、核酸擴(kuò)增、高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，其中單細(xì)胞分離和核酸擴(kuò)增是核心技術(shù).

1.1 單細(xì)胞分離

SCS 的第一步是將單個(gè)細(xì)胞從組織樣本中分離出來，以獲得合格的單細(xì)胞懸浮. 目前，許多技術(shù)方法已用于單細(xì)胞分離，其中包括連續(xù)稀釋法、顯微操作法、熒光激活細(xì)胞分選（Fluorescence-activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS）、免疫磁珠分離（Immunomagnetic Bead Separation，IMS）、激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser Capture Microdissection，LCM）和微流控平臺(tái). 這些方法各具優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，研究人員可根據(jù)單細(xì)胞的具體情況選擇合適的分離方法.

1.1.1 連續(xù)稀釋法

該方法基于細(xì)胞培養(yǎng)原理，單細(xì)胞樣本通過稀釋細(xì)胞群一系列倍數(shù)來制備. 由于其操作方便、成本低廉、具有特殊裝置的獨(dú)立性，該方法已成功應(yīng)用于來自體外不同組織的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的克隆形成分析［1-2］.而這種方法有以下缺點(diǎn)：嚴(yán)重依賴梯度稀釋的計(jì)算；很容易發(fā)生分離錯(cuò)誤或細(xì)胞丟失的情況；該方法耗時(shí)長，通量率低，無法準(zhǔn)確過濾目標(biāo)細(xì)胞.

1.1.2 顯微操作法

顯微操作法是分離未培養(yǎng)的微生物或早期胚胎的經(jīng)典方法，它使用毛細(xì)管移液器從細(xì)胞懸架中吸出單個(gè)細(xì)胞，在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)和著色特性進(jìn)行目視檢查［3-4］. 機(jī)械微操作的缺點(diǎn)是，吞吐量低，耗時(shí)長，在操作過程中機(jī)械剪切會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷.

1.1.3 熒光激活細(xì)胞分選

熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)可根據(jù)單個(gè)細(xì)胞的大小、粒度和熒光特性每分鐘分離數(shù)十萬個(gè)細(xì)胞. 高吞吐量、省時(shí)性和自動(dòng)性能是它的主要優(yōu)勢(shì). 此外，研究人員可通過給靶細(xì)胞貼上特定熒光抗體的標(biāo)簽，將特定的單個(gè)細(xì)胞與異質(zhì)細(xì)胞樣本分離［5］. 雖然分揀過程復(fù)雜，但這種實(shí)驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)成熟，有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)遵循.

1.1.4 免疫磁珠分離法

在免疫磁珠分離法中，磁珠可以將細(xì)胞表面抗原與特定的單克隆抗體結(jié)合. 與磁珠相連的表面抗原細(xì)胞被吸附并保留在磁場(chǎng)中，但未與磁珠相連的細(xì)胞不會(huì)留在磁場(chǎng)中，因此目標(biāo)細(xì)胞可以快速分離. 雖然此操作相對(duì)復(fù)雜，但它已經(jīng)被用來從腫瘤樣本中分離單細(xì)胞［6］.

1.1.5 激光捕獲顯微切割技術(shù)

激光捕獲顯微切割技術(shù)通過用激光束熔化透明膜蓋，然后冷卻后將細(xì)胞固定在膠黏膜上，從而能夠快速準(zhǔn)確地從組織樣本中獲取單細(xì)胞亞群或單細(xì)胞懸浮液，從而進(jìn)一步分析細(xì)胞異質(zhì)性. 在倒置顯微鏡下，目標(biāo)組織切片或細(xì)胞有選擇地固定在激光脈沖活性熱塑性膜（醋酸乙烯、聚乙烯四乙酸鹽酯或聚乙二醇四磷酸鹽膜）上的涂片中［7］. 該技術(shù)可以顯示細(xì)胞的空間位置，并快速準(zhǔn)確地分離細(xì)胞，而無須細(xì)胞懸浮. 然而，激光捕獲顯微切割技術(shù)尚有成本高、通量低、缺乏自動(dòng)化和精度有限等缺點(diǎn). 另外，細(xì)胞核很容易被切割，導(dǎo)致在該過程中會(huì)丟失一些染色體片段，并且切割過程中可能會(huì)涉及相鄰細(xì)胞的原生體成分或受損的細(xì)胞核. 大多數(shù)RNA在準(zhǔn)備單細(xì)胞懸浮時(shí)會(huì)降解，因此這種方法不適合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析.

1.1.6 微流控平臺(tái)

微流控平臺(tái)是一種新開發(fā)的高度集成的系統(tǒng)，可按順序處理或操縱少量流體在尺寸為幾十到幾百微米的通道中實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)序，該通道已應(yīng)用于單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)［8-9］. 微流體的優(yōu)點(diǎn)是能夠輸入納升到皮升的樣品量，并輸出高分辨率和靈敏度的準(zhǔn)確結(jié)果［8］. 此外，微流控可以進(jìn)行平行和快速地分析，提高研究效率.

1.2 核酸擴(kuò)增

核酸擴(kuò)增是通過酶的作用將待檢核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，包括全基因組擴(kuò)增和全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增.

1.2.1 全基因組擴(kuò)增

為了在單個(gè)細(xì)胞中均勻擴(kuò)增基因組DNA，已經(jīng)開發(fā)了全基因組擴(kuò)增（Whole Genome Amplification，WGA）方法［10］，包括簡(jiǎn)并寡核苷酸引發(fā)的聚合酶鏈反應(yīng)（Degenerative Oligonucleotide PCR，DOP-PCR）、多重置換擴(kuò)增（Multiple Displacement Amplification，MDA）和多重退火和基于環(huán)的擴(kuò)增循環(huán)（Multiple Annealing and Loop Based Amplification Cycles，MALBAC）. MDA是一種利用具有鏈置換活性和高保真度的聚合酶的方法，可以實(shí)現(xiàn)基因組的高覆蓋率，但會(huì)產(chǎn)生不均勻的擴(kuò)增. MALBAC以其獨(dú)特的準(zhǔn)線性擴(kuò)增特征，減少了指數(shù)擴(kuò)增加劇的序列依賴性偏差且已應(yīng)用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)量［11］. DOP-PCR 通常會(huì)產(chǎn)生低基因組覆蓋率，但DOP-PCR 非常適合在具有100萬個(gè)堿基的大型基因組規(guī)模上測(cè)量CNV［1］.

1.2.2 全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增

SMART-seq［12］是一種利用寡核苷酸引物和模板切換進(jìn)行全長cDNA 擴(kuò)增的全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增（Whole Transcriptome Amplification，WTA）方法. SMART-Seq24、Quartz-seq5 和CEL-seq6 也已經(jīng)被開發(fā)出來，可以穩(wěn)定地測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的mRNA. 盡管存在多種WTA方法，但因其需處理成百上千個(gè)單細(xì)胞和少量液體，所以進(jìn)行scRNA-seq仍存在一定難度.

1.3 高通量測(cè)序

高通量測(cè)序包括單細(xì)胞基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表觀遺傳學(xué)測(cè)序，可以揭示細(xì)胞在不同階段、不同方面的功能和特征. 這種方法可以同時(shí)對(duì)數(shù)百萬個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，從而有可能全面分析物種的轉(zhuǎn)錄體和基因組，通過提高測(cè)序速度和降低測(cè)序成本，有效提高了我們確定和診斷人類疾病根本原因以及評(píng)估復(fù)雜疾病風(fēng)險(xiǎn)的能力.

1.3.1 單細(xì)胞基因組學(xué)測(cè)序

單細(xì)胞基因組測(cè)序能夠闡明遺傳異質(zhì)性，它可用于分析正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中的新生種系突變和體細(xì)胞突變. 突變?cè)诩?xì)胞中獨(dú)立積累并導(dǎo)致衰老和疾病，例如發(fā)育疾病和癌癥. Zhang等［13］報(bào)告了一項(xiàng)關(guān)于B淋巴細(xì)胞體細(xì)胞突變的單細(xì)胞全基因組測(cè)序研究，并觀察到體細(xì)胞突變隨年齡增長而積累以及與B細(xì)胞癌的致癌性有關(guān)的突變特征.

1.3.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序

scRNA-seq 允許比較單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組. 因此，scRNA-seq 的一個(gè)主要用途是評(píng)估細(xì)胞群內(nèi)轉(zhuǎn)錄的相似性和差異. RNA-seq 實(shí)現(xiàn)了高通量基因表達(dá)譜分析，可以深入了解基因型和表型之間的功能聯(lián)系［14］.RNA-seq 分析通常測(cè)量細(xì)胞混合物（稱為“批量”）中的轉(zhuǎn)錄本. 批量RNA-seq 分析允許僅測(cè)量細(xì)胞群中的平均轉(zhuǎn)錄表達(dá). 例如，在癌癥組織的RNA-seq 中，分析了來自各種類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本，包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞. 為了測(cè)量單個(gè)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄物，必須從極少量的RNA中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription，RT）和cDNA擴(kuò)增［15］.

1.3.3 單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)測(cè)序

單細(xì)胞表觀基因組測(cè)序用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞分化足跡. 通過闡明細(xì)胞的表觀基因組狀態(tài)，如DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)，我們可以觀察單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞譜系和分化狀態(tài). 單細(xì)胞DNA 甲基化分析可以通過單細(xì)胞亞硫酸氫鹽測(cè)序（single cell Bisulfite Sequencing，scBS-seq）和單細(xì)胞減少代表性亞硫酸氫鹽測(cè)序（single cell Reduced Representation Bisulfite Sequencing，scRRBS）進(jìn)行分析［15］. Smallwood 等［16］報(bào)道了一種scBS-seq方法，可用于精確測(cè)量高達(dá)48.4%的CpG 位點(diǎn)的DNA 甲基化. Guo 等［17］描述了一種甲基化組分析技術(shù)，該技術(shù)能夠基于scRRBS進(jìn)行單細(xì)胞和單堿基分辨率DNA甲基化分析. 研究染色質(zhì)狀態(tài)，可以使用多種方法來測(cè)量單個(gè)細(xì)胞中組蛋白修飾的模式. Rotem等［18］用單細(xì)胞ChIP-seq揭示由染色質(zhì)狀態(tài)定義的細(xì)胞亞群.單細(xì)胞ChIP-seq 可以通過稱為Drop-ChIP 55的基于液滴微流體的程序進(jìn)行. Grosselin 等［19］最近進(jìn)行了單細(xì)胞染色質(zhì)免疫沉淀和測(cè)序（single cell Chromatin Immunoprecipitation followed by sequencing，scChIP-seq），以分析患者來源的乳腺癌異種移植物（Patient-Derived Xenograft，PDX）的H3K27me3 染色質(zhì)景觀和特征.Kaya-Oku 等［20］描述了靶標(biāo)和標(biāo)記下的裂解（CUT&Tag），這是一種酶系鏈策略，可提供高效的高分辨率測(cè)序文庫，用于分析不同的染色質(zhì)成分.

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 單細(xì)胞基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

獲得帶有測(cè)序讀數(shù)的文件后，數(shù)據(jù)分析的第一步是映射到參考基因組［21］. 大多數(shù)模式生物的基因組DNA序列可以從各種在線數(shù)據(jù)庫中輕松獲得. 在映射之前，建議檢查讀取質(zhì)量并修剪低質(zhì)量堿基以及讀取末尾的剩余適配器序列. 但是，如果剩余讀取長度太短，則應(yīng)丟棄讀取以避免錯(cuò)誤映射，此外，建議刪除PCR重復(fù)項(xiàng). 執(zhí)行映射后，映射到多個(gè)基因座的讀數(shù)應(yīng)被丟棄或計(jì)數(shù)，每個(gè)基因座的統(tǒng)一權(quán)重降低，以便每個(gè)讀數(shù)的權(quán)重加起來為1，后續(xù)處理取決于分析類型. 為了確定CNV，可以通過將基因組分割成Bin來減輕讀取覆蓋率的局部變異性［22-23］. 例如，圓形二元分割算法［22］使用t統(tǒng)計(jì)量和置換參考分布來推斷斷點(diǎn)的P值. 另一項(xiàng)研究采用隱馬爾可夫模型進(jìn)行CNV檢測(cè)，隱狀態(tài)對(duì)應(yīng)于本地拷貝數(shù)［24］. 在使用源自非癌細(xì)胞的歸一化因子消除擴(kuò)增偏差后，推斷出癌細(xì)胞中的異?？截悢?shù). 該模型的發(fā)射概率對(duì)應(yīng)于指示癌細(xì)胞是否具有比正常細(xì)胞更高的拷貝數(shù)的二元載體.

基因組分析工具包GATK含有一系列用于處理下一代測(cè)序數(shù)據(jù)和變異調(diào)用的方法，例如，可用于單核苷酸多肽性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）檢測(cè)的貝葉斯框架.

1.4.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

1）質(zhì)量控制. 分析scRNA-seq 的第一步是排除那些不太可能代表完整的單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞條碼［25］. 最直接的方法是計(jì)算一個(gè)數(shù)據(jù)集的特定閾值，即認(rèn)為一個(gè)條形碼是一個(gè)細(xì)胞所需的最小數(shù)量的唯一分子識(shí)別符（Unique Molecular Identifier，UMI）［26］.

2）標(biāo)準(zhǔn)化. 從測(cè)序?qū)嶒?yàn)中獲得的有用讀數(shù)的數(shù)量在不同的細(xì)胞之間會(huì)有所不同，我們必須對(duì)這種差異進(jìn)行校正［25］. 對(duì)于scRNA-seq 數(shù)據(jù)，這種影響是明顯的，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞的RNA 數(shù)量會(huì)因?yàn)榧?xì)胞周期階段和其他生物因素而有很大的不同，即使是在同一細(xì)胞類型中.

3）批量效果校正. 與測(cè)序深度的差異類似，批效應(yīng)是技術(shù)上的混淆因素，必須加以解釋才能產(chǎn)生真正的生物信號(hào)［25］. 批效應(yīng)是生物學(xué)中常見的問題，它是由實(shí)驗(yàn)時(shí)間、實(shí)驗(yàn)人員、試劑等非生物因素的差異引起的. 如果不加以適當(dāng)解釋，批效應(yīng)可能會(huì)被誤認(rèn)為是真正的生物信號(hào)，但通過仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，它們完全可以避免.

4）代入法和平滑法. 原則上，去除零可以減少噪音，并使其更容易識(shí)別數(shù)據(jù)的潛在結(jié)構(gòu)（如基因-基因相關(guān)性、細(xì)胞簇、標(biāo)記基因或發(fā)育軌跡）. 已經(jīng)開發(fā)了一些工具來“輸入”在scRNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的零值，包括scImpute，DrImpute和SAVER. 其他工具，如使用擴(kuò)散模型的MAGIC 和使用自動(dòng)編碼器的scVI，應(yīng)用平滑算法來降低噪聲.

5）細(xì)胞周期分配. 如果樣品中含有活躍循環(huán)的細(xì)胞，這可能會(huì)導(dǎo)致生物混雜物，可能需要在下游分析中去除. 另外，細(xì)胞周期的階段可能是正在研究的生物學(xué)問題的興趣所在. 無論哪種情況，都有必要將細(xì)胞分配到適當(dāng)?shù)募?xì)胞周期階段［25］. 有兩種廣泛使用的工具來識(shí)別細(xì)胞周期階段：Cyclone和Seurat.

6）特征選擇. 特征選擇識(shí)別出相對(duì)于技術(shù)噪聲具有最強(qiáng)生物信號(hào)的基因. 通過將下游分析限制在信息量最大的基因上，減少維數(shù)的影響，降低噪聲，簡(jiǎn)化分析［25］. 最廣泛使用的特征選擇策略是考慮高可變基因（即方差高于預(yù)期的基因）.

7）降維和可視化. 減少表達(dá)式矩陣高維的負(fù)面影響的另一種策略是對(duì)降維后的特征空間進(jìn)行降維［25］.最常用的策略包括主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），這是一種線性變換，在完整的主成分空間中保持單元間的歐氏距離，即使對(duì)非常大的數(shù)據(jù)集也能有效計(jì)算. 目前的最佳實(shí)踐方法是統(tǒng)一流形逼近和投影降維（Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP）［27］. 該算法使用一個(gè)cell-cell最近鄰網(wǎng)絡(luò)來近似數(shù)據(jù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，估計(jì)數(shù)據(jù)的低維嵌入能使結(jié)構(gòu)保持最好. UMAP在很大程度上取代了t分布隨機(jī)鄰居嵌入（t-distribution Stochastic Neighbour Embedding，t-SNE），因?yàn)樗軌蚋玫乇４娲笠?guī)模結(jié)構(gòu).

8）無監(jiān)督聚類. 對(duì)scRNA-seq 數(shù)據(jù)的無監(jiān)督聚類是大多數(shù)分析的中心，因?yàn)樗梢宰R(shí)別具有相似表達(dá)譜的細(xì)胞組. 其中一些組可以代表不同的細(xì)胞類型，其他組可以被認(rèn)為是中間細(xì)胞狀態(tài)（例如，細(xì)胞周期階段）［25］. 無監(jiān)督聚類的算法包括廣泛使用的k-means算法、用于網(wǎng)絡(luò)聚類的Louvain算法等.

9）擬時(shí)間. 如果數(shù)據(jù)集代表了一個(gè)發(fā)展過程，或者是從一個(gè)時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)中衍生出來的，那么從一個(gè)連續(xù)體來看細(xì)胞是更合適的. 這種連續(xù)的軌跡，可以表示空間位置、化學(xué)濃度或時(shí)間過程，通常被稱為“偽時(shí)間”，每個(gè)細(xì)胞都可以被分配一個(gè)特定的位置［25］. 第一種方法是使用降維技術(shù)來識(shí)別細(xì)胞所在的低維“流形”，并使用細(xì)胞-細(xì)胞圖來描述流形的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；第二種方法是在鏈接集群并將單個(gè)單元投射到分支上之前，使用無監(jiān)督集群對(duì)單元進(jìn)行分組.

10）差異性表達(dá). 差異表達(dá)（Differential Expression，DE）是RNA 測(cè)序中最重要的應(yīng)用之一，因?yàn)樗峁┝嗽趦煞N或兩種以上生物學(xué)條件下受干擾的基因列表. 對(duì)scRNA-seq的DE更有挑戰(zhàn)性，因?yàn)槲覀儾粌H僅是比較每個(gè)基因的單個(gè)值，還可以比較表達(dá)水平的分布［25］. 最近的一項(xiàng)比較得出結(jié)論，非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn)比其他方法表現(xiàn)得更好［28］.

11）比較和合并數(shù)據(jù)集. 隨著scRNA-seq數(shù)據(jù)量的持續(xù)增長，一個(gè)重要的挑戰(zhàn)是確定如何最好地組合數(shù)據(jù)集. 當(dāng)組合來自不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)時(shí)，批處理效應(yīng)是一個(gè)主要的挑戰(zhàn)，而且即使它們可以被克服，重新分析合并的數(shù)據(jù)集可能需要大量的時(shí)間、精力和存儲(chǔ)［25］. 合并數(shù)據(jù)集的另一種策略是對(duì)它們進(jìn)行比較，當(dāng)數(shù)據(jù)集非常大時(shí)（例如，細(xì)胞圖集），適用這種策略.

1.4.3 單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)分析

通?？捎糜谔幚泶笠?guī)模表觀基因組數(shù)據(jù)的工具包括動(dòng)態(tài)測(cè)序數(shù)據(jù)可視化工具，例如AnnoJ和綜合基因組學(xué)查看器（http：//www.broadinstitute.org/igv）. 盡管UCSC基因組瀏覽器或ENSEMBL等標(biāo)準(zhǔn)工具也可用于可視化目的，但這些工具專門針對(duì)處理大量讀取進(jìn)行了優(yōu)化，并動(dòng)態(tài)響應(yīng)用戶請(qǐng)求，因此它們無須從服務(wù)器響應(yīng)用戶操作. 這些工具旨在安裝在本地并允許快速縮放和導(dǎo)航. 同樣，通用生物信息學(xué)平臺(tái)Galaxy提供了執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作的簡(jiǎn)單方法，例如重疊基因組片段和基于基因組區(qū)間計(jì)算各種統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù). EpiGRAPH是一個(gè)通用工具，用于處理表觀遺傳數(shù)據(jù)集. 與Galaxy類似，它允許用戶上傳有關(guān)基因組區(qū)域信息的文件（例如，富含乙?；M蛋白的區(qū)域）. EpiGRAPH 還可以計(jì)算各種預(yù)加載或用戶提供的特征（2010年初大約有1000 個(gè)預(yù)加載特征）的上傳區(qū)域的豐富度. 該軟件還可以構(gòu)建分類器，能夠從給定的基因組區(qū)域預(yù)測(cè)目標(biāo)變量的值.

2 單細(xì)胞測(cè)序的應(yīng)用領(lǐng)域

2.1 早期胚胎學(xué)

早期胚胎學(xué)研究內(nèi)容多發(fā)生在胚胎發(fā)育前期. 傳統(tǒng)的胚胎學(xué)在基礎(chǔ)研究上缺乏對(duì)微觀過程的剝離，但基于SCS的胚胎學(xué)能很好地彌補(bǔ)這一點(diǎn). 如研究通過對(duì)靈長類動(dòng)物的胚胎植入，得出受精卵或雙細(xì)胞階段的多極分裂和染色體的細(xì)胞片段相關(guān)，這將對(duì)解決試管嬰兒失敗和胚胎丟失有著重要的意義；對(duì)于胚胎發(fā)育過程，尚且有很多組織結(jié)構(gòu)和過程產(chǎn)物的作用機(jī)制不清楚，SCS優(yōu)于傳統(tǒng)學(xué)科，它的運(yùn)用可避免母體干擾，建立體外培養(yǎng)系統(tǒng)［29］，獨(dú)立創(chuàng)建模型了解靶向生物標(biāo)志物和多系統(tǒng)參與的生物機(jī)制，例如胚胎-神經(jīng)系統(tǒng)等. 有研究通過分析小鼠2-細(xì)胞期胚胎的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本，揭示了對(duì)高強(qiáng)度光照的綜合反應(yīng)，包括形態(tài)變化、長期傷害效應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)損傷修復(fù)機(jī)制［30］.

2.2 免疫學(xué)

免疫學(xué)是研究生物體對(duì)抗原物質(zhì)免疫應(yīng)答性及其方法的生物醫(yī)學(xué)科學(xué). 利用免疫應(yīng)答的特異性，植入SCS方法的免疫學(xué)可以結(jié)合多方法多學(xué)科，實(shí)現(xiàn)單一學(xué)科不能實(shí)現(xiàn)的功能，如免疫細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序?qū)δ[瘤免疫治療效果的預(yù)測(cè)［31］、研究對(duì)自身免疫性疾病和免疫缺陷疾病的治療［32］、研究對(duì)衰老與免疫反應(yīng)的關(guān)系［33］以及包括對(duì)當(dāng)前熱度很高的新型冠狀病毒在內(nèi)的細(xì)菌病毒微生物類與免疫反應(yīng)的研究等［34］.

SCS技術(shù)可以揭示宿主免疫應(yīng)答的內(nèi)在異質(zhì)性，準(zhǔn)確評(píng)估免疫細(xì)胞激活過程中涉及的特定分子機(jī)制. 霍爾特等人通過SCS技術(shù)鑒定出罕見的CD4 T細(xì)胞［35］. 總之，這些研究全面證明，SCS技術(shù)可以揭示基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、異質(zhì)性和免疫細(xì)胞的隨機(jī)表達(dá)等遺傳信息，為研究人員為免疫疾病提供更多的治療選擇奠定理論基礎(chǔ).

2.3 腫瘤學(xué)

癌癥的特異性來源于其本身克隆多樣性以及突變的不確定性，這都會(huì)增大治療的難度和降低患者的生存率［36］，SCS技術(shù)作為一種理想的工具以其特異性和操作的獨(dú)立性已廣泛應(yīng)用于各種原發(fā)性的癌癥治療，如食管癌、肺癌、乳腺癌和宮頸癌等［37］.

通過對(duì)骨髓異常導(dǎo)致的白血病的單細(xì)胞測(cè)序，對(duì)比患者與對(duì)照的基因表達(dá)水平，可以較為容易地找到炎癥相關(guān)作用通路和與骨髓系白血病相關(guān)的敏感基因［38］. 對(duì)于黑色素瘤的治療，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的介入用于識(shí)別黑色素瘤的預(yù)后亞型，特別強(qiáng)調(diào)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞. 治療抗性機(jī)制不僅包括預(yù)先存在的亞克隆的選擇過程，還包括不同基因表達(dá)狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換［39］；對(duì)于一些新起的癌癥治療技術(shù)，單細(xì)胞測(cè)序也可以很好地從微觀的角度做出有效評(píng)價(jià).

2.4 微生物學(xué)

目前的自然條件下微生物的種類雖然繁多，但想要依賴自然條件批量使用特定微生物或?qū)δ承┪⑸镞M(jìn)行生物多樣性研究卻是一道門檻. 然而隨著SCS技術(shù)的加入，許多問題都有望得到解決［40］. 對(duì)于對(duì)抗某些有害微生物，如通過對(duì)大豆胞囊線蟲的抗性基因的破壞，用SCS技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)區(qū)域的差異性，對(duì)比得出某些序列多態(tài)性是線蟲所特有的，從而獲得抗線蟲毒性的方法［41］；同樣對(duì)于曼氏血吸蟲的研究，了解其生命周期的不同階段作用和特點(diǎn)，可以很有效地采取對(duì)應(yīng)的防治措施［42］. 而對(duì)于人類生產(chǎn)生活有幫助的微生物，SCS也是大有建樹的，如針對(duì)有利于海洋生態(tài)的大型硫細(xì)菌，運(yùn)用SCS揭示氧化帶、硫化帶和海洋微生物之間循環(huán)的機(jī)制，研究這些絲狀硫氧化細(xì)菌的基因組，大大加深了對(duì)它們的進(jìn)化及其對(duì)海洋沉積物中硫和氮循環(huán)作用的理解［43］.

2.5 神經(jīng)生物學(xué)

神經(jīng)細(xì)胞的多樣性以及神經(jīng)元的異質(zhì)性是導(dǎo)致神經(jīng)研究艱巨的重要原因之一［44］，但SCS技術(shù)的加入，使得對(duì)神經(jīng)方向的研究更具有方向性. 對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的研究，有望解釋特異性突變與人類某些疾病的起源有關(guān)以及了解突變與人體衰老的關(guān)聯(lián)性大?。?5］；通過在單細(xì)胞與神經(jīng)元池，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組方法在單個(gè)激光捕獲神經(jīng)元以及相應(yīng)海馬區(qū)的基因表達(dá)譜比較患病和正常人群，有效得出神經(jīng)疾病的基因作用靶部位［46］；同樣，也可以用SCS技術(shù)評(píng)價(jià)某些有毒有害物質(zhì)對(duì)神經(jīng)組織的損害程度和毒作用機(jī)理［47］.

2.6 干細(xì)胞研究

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞，鑒于這種特性，可以通過將干細(xì)胞或相關(guān)衍生產(chǎn)品移植入患者體內(nèi)，替換損傷細(xì)胞從而治愈疾病. 但傳統(tǒng)的干細(xì)胞研究的局限性在于干細(xì)胞分化可導(dǎo)致成瘤性，且在腫瘤研究中大多數(shù)腫瘤干細(xì)胞缺乏特異性的標(biāo)志物，組織定位和形態(tài)特征不明確，因此無法直接從腫瘤細(xì)胞中分離，這樣會(huì)使工作量加重，有時(shí)甚至無法進(jìn)行. 將SCS技術(shù)運(yùn)用于干細(xì)胞研究，可以拓寬研究方向，如器官再生、解釋生物過程、解釋生物效應(yīng)等. 如果單細(xì)胞技術(shù)可運(yùn)用于生物工程肺的發(fā)展，這對(duì)終末期肺衰竭需要肺移植來說可能是唯一的方法［48］；解釋干細(xì)胞增殖和凋亡的轉(zhuǎn)錄后作用［49］；揭示干細(xì)胞的功能，如視網(wǎng)膜細(xì)胞的有序誕生方面的可行性和潛力［50］等. 使用單細(xì)胞分析的類似策略可為其他類型的器官分化研究提供信息，并將促進(jìn)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展.

3 總結(jié)或展望

單細(xì)胞測(cè)序（SCS）作為NGS方法，它的超高分辨率為我們對(duì)生命科學(xué)的許多領(lǐng)域的理解提供了新的視角，主要用于分析細(xì)胞間遺傳和蛋白質(zhì)信息的差異，獲取單細(xì)胞水平基因組序列信息，更好地理解它們?cè)谖h(huán)境中的特定作用. 通過對(duì)單個(gè)細(xì)胞的全基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組進(jìn)行測(cè)序，可以揭示疾病發(fā)生和發(fā)展過程中復(fù)雜的異質(zhì)性機(jī)制，進(jìn)一步提高疾病診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)和藥物療效監(jiān)測(cè)［51-52］. 傳統(tǒng)測(cè)序方法只能得到多個(gè)細(xì)胞的平均值，無法分析少量細(xì)胞、丟失細(xì)胞異質(zhì)性信息. 與傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)相比，單細(xì)胞技術(shù)具有檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞間異質(zhì)性、區(qū)分少量細(xì)胞、勾畫細(xì)胞圖譜等優(yōu)點(diǎn). 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)仍存在操作煩瑣、檢測(cè)成本高等問題，限制了技術(shù)的推廣［53］. 但可預(yù)見通過技術(shù)的不斷發(fā)展，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)將會(huì)有更廣泛的應(yīng)用.