陳 興,李紅衛(wèi),趙永健,馮世海

(南開大學(xué)附屬醫(yī)院 天津市第四醫(yī)院燒傷科,天津 300222)

膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，它是嚴重創(chuàng)(燒)傷、休克、感染及外科大手術(shù)患者常見的并發(fā)癥，進一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(MODS)，是臨床危重患者最主要死亡原因之一[1]。在膿毒癥導(dǎo)致的MODS中，以膿毒癥急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)發(fā)病率和死亡率最高，是現(xiàn)代創(chuàng)(燒)傷外科及危重病醫(yī)學(xué)面臨的突出難題[2]。研究表明機體過度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的肺泡Ⅱ型上皮細胞(AT-Ⅱ)功能紊亂與膿毒性休克和 MODS 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡通路是引發(fā)AT-Ⅱ凋亡的重要途徑，在AT-Ⅱ凋亡中起關(guān)鍵作用，不同凋亡途徑都通過作用于線粒體來決定凋亡是否發(fā)生[4]。線粒體是雙膜結(jié)構(gòu)的細胞器，主要通過氧化磷酸化合成 ATP，為細胞的持續(xù)運行提供能量，與此同時,也可生成活性氧簇(ROS)[5]。ROS可引起線粒體的損傷,釋放促凋亡因子,以及開放線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔等導(dǎo)致細胞的死亡[6]。因此，在急性肺損傷過程中清除肺泡Ⅱ型上皮細胞中的受損線粒體具有重要意義。

Christian de Duve 在1980年提出“自噬(autophagy)”的概念，是細胞蛋白質(zhì)和細胞器通過自身溶酶體將其降解的一個過程[7]。具體過程為由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體形成的雙層脂質(zhì)膜，將細胞內(nèi)的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)聚集體，多種細胞器)進行擴展、吞噬，并包裹在自噬體之中，該自噬體往往是雙層膜結(jié)構(gòu)；之后，通過與溶酶體相互融合繼而成熟，自噬體中包裹的內(nèi)容物再利用溶酶體酶降解，最后降解產(chǎn)物被轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，進行回收利用[8]。可見，自噬可將受損細胞進行回收，可通過清除非功能性蛋白質(zhì)和細胞器來維持細胞穩(wěn)定[9]。線粒體自噬這一概念首次由Lemasters等提出[10]，線粒體嚴重損傷或融合受損后，線粒體內(nèi)碎片會逐漸增多，這些碎片、受損和衰老的線粒體隨后被細胞選擇性地清除，從而達到維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程。在肺泡Ⅱ型上皮細胞中，線粒體自噬通過調(diào)節(jié)線粒體的質(zhì)量與數(shù)量維持其正常運行，但當受到氧化應(yīng)激、缺血、缺氧等刺激時，過度的線粒體自噬或線粒體自噬不足均可影響肺泡Ⅱ型上皮細胞的功能，甚至導(dǎo)致肺泡Ⅱ型上皮細胞死亡，因此嚴格控制肺泡Ⅱ型上皮細胞中線粒體自噬的激活程度將十分必要[11]。線粒體自噬僅存在于哺乳動物細胞中，是其特有的選擇性自噬方式。目前對線粒體自噬調(diào)控通路的研究中，發(fā)現(xiàn)主要有NIX/BNIP3和FUDNC1以及PINK1/Parkin三條信號通路[12-13]。其中，目前研究最廣泛的線粒體自噬途徑為Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，本文就其在急性肺損傷中的作用予以綜述。

1 Pink1、Parkin 的結(jié)構(gòu)及其介導(dǎo)的線粒體自噬

1.1Pink1、Parkin的結(jié)構(gòu)：Pink1蛋白作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶發(fā)揮作用，含有581種氨基酸殘基，由N端線粒體靶向序列、跨膜結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)組成[14]。其N端為靶定信號，連接疏水跨膜區(qū)，為線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移終止信號，156～509之間的殘基構(gòu)成絲氨酸/蘇氨酸跨膜結(jié)構(gòu)域，連接C端結(jié)構(gòu)域，作為線粒體外膜滯留信號[15]。其N端線粒體靶向序列在線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶和線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶的作用下將Pink1導(dǎo)入線粒體內(nèi)[16]，經(jīng)早老素相關(guān)菱形蛋白降解，使Pink1維持在較低表達水平[17]。通常在生理情況下，細胞內(nèi)Pink1含量極低，而在細胞受到相關(guān)刺激，導(dǎo)致線粒體膜電位受損時，PINK1進入線粒體內(nèi)膜的路徑被阻斷；此時，PINK1將逐漸聚集于受損的線粒體外膜，并將Parkin募集至受損線粒體[18]。

Parkin是一種E3泛素連接酶，多數(shù)位于細胞質(zhì)、少數(shù)位于線粒體，由465種氨基酸組成，其N端是一個泛素樣結(jié)構(gòu)域和4個富含半胱氨酸并能與鋅結(jié)合的RING結(jié)構(gòu)域[19]。其中，泛素樣結(jié)構(gòu)域可以被Pink1 磷酸化激活[20]。Parkin 主要位于胞質(zhì)中，既具有連接酶的活性，使底物被蛋白酶識別并降解，又可以通過單泛素化底物或由泛素內(nèi)賴氨酸形成泛素化長鏈，從而調(diào)控信號通路[21]。

1.2Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬：經(jīng)典的線粒體自噬途徑為Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，它也是目前受到關(guān)注最多的線粒體自噬途徑，得到的研究也最廣泛。細胞在受到多種刺激條件刺激下(如：營養(yǎng)缺乏、細胞衰老、炎性反應(yīng)、缺血、缺氧等)，細胞內(nèi)線粒體的代謝方式由有氧代謝轉(zhuǎn)化為無氧代謝，線粒體外膜被誘導(dǎo)產(chǎn)生去極化，致使線粒體內(nèi)外膜轉(zhuǎn)位酶和水解酶功能均發(fā)生障礙，阻斷Pink1的轉(zhuǎn)位與降解，使得Pink1聚集在線粒體上[22]; 然后，位于Parkin的絲氨酸65殘基和泛素被Pink1磷酸化，從而激活Parkin[23]; 同時，Pink1 在蘇氨酸11和絲氨酸42處對線粒體外膜融合蛋白2磷酸化，從而招募Parkin聚集[14]; 最后，聚集在線粒體外膜的Parkin 將外膜蛋白泛素化，進而與微管相關(guān)蛋白相結(jié)合，并逐漸將受損或碎片化的線粒體包裹進自噬體中，進一步與溶酶體相融合，從而降解與清除這些受損線粒體[24]。Pink1和 Parkin的缺失會使細胞對受損線粒體的降解能力降低，使得受損細胞器累積，最終導(dǎo)致細胞死亡[25]。因此，Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬對于維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細胞生存具有重要意義。

2 Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)控

2.1Pink1的磷酸化與Parkin的泛素化調(diào)控：線粒體外膜去極化后，聚集在其表面的Pink1可以通過磷酸化泛素來激活和招募Parkin，而含EF-hand結(jié)構(gòu)域2的蛋白磷酸酶可拮抗Pink1的磷酸酶，抑制Pink1依賴的線粒體自噬[26]。蛋白磷酸酶PTEN-L也可抑制泛素磷酸化，阻斷磷酸化泛素鏈的形成;此外，PTEN-L還可防止Parkin向線粒體的移位，抑制Parkin的E3泛素連接酶活性，并阻止其誘導(dǎo)的線粒體自噬[27]。由此可見，Pink1的磷酸化在Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬中具有重要的調(diào)控作用。在Parkin泛素化在Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)節(jié)作用中，泛素特異性蛋白酶30起到對抗Parkin介導(dǎo)的泛素化的作用，從而抑制線粒體自噬的發(fā)生[28]。而泛素特異性蛋白酶33可以從Parkin中去除泛素耦聯(lián)物，在Lys435處使Parkin去泛素化，抑制Parkin蛋白轉(zhuǎn)移至去極化的線粒體上，從而抑制線粒體自噬的發(fā)生[29]。因此，Pink1的磷酸化功能與Parkin泛素化功能的調(diào)控可以影響其介導(dǎo)的線粒體自噬的激活，達到控制線粒體質(zhì)量和數(shù)量平衡的目的。

2.2氧化應(yīng)激對 Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)控：活性氧類(ROS)是線粒體在呼吸作用中產(chǎn)生惡副產(chǎn)物。ROS可以啟動一系列氧化損傷反應(yīng)，破壞線粒體膜蛋白，使線粒體 DNA 發(fā)生突變，翻譯異常，進而使得異常蛋白質(zhì)增加，并發(fā)生錯誤折疊與聚集；同時，ROS還可致使線粒體通透性發(fā)生轉(zhuǎn)變，引起線粒體腫脹、功能失調(diào)等一系列改變，最終導(dǎo)致細胞凋亡增加[30]。Eliza Tsitoura對比了原發(fā)性肺纖維化(IPF)患者與健康個體肺泡灌洗液中線粒體活性氧(mtROS)、線粒體形態(tài)、相關(guān)基因表達和線粒體自噬相關(guān)因子PINK1、PARK2和NRF1水平。結(jié)果提示IPF患者肺泡巨噬細胞中的線粒體存在明顯的形態(tài)學(xué)缺陷和轉(zhuǎn)錄受損，與線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子PINK1、PARK2和NRF1的顯著減少平行。同時，mtROS在IPF中顯著升高，提示在IPF患者中ROS可激活線粒體自噬的過程[31]。

研究顯示，ROS 是線粒體自噬的必要條件[32]。羰基氰化物間氯苯腙可促進ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)線粒體去極化，將過氧化物酶6招募到去極化的線粒體上，促進Parkin從細胞質(zhì)通過線粒體外膜轉(zhuǎn)移到線粒體中，最后通過自噬途徑將受損線粒體清除[33]。另有研究顯示，鄰苯二甲酸二-2-乙基己基酯和1，4-苯醌均可通過增加 ROS 的產(chǎn)生，降低線粒體膜電位，增強線粒體碎片化，加劇了線粒體損傷，同時，增加磷酸化泛素(pSer 65 Ub)水平，并導(dǎo)致Parkin在線粒體激活、易位，進而激活線粒體自噬通路[34]。

氧化應(yīng)激及其主要產(chǎn)物ROS是 Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬發(fā)生的重要調(diào)控因素，因此可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平來對 Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬進行調(diào)控。

2.3血紅素加氧酶-1(HO-1)對 Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)控：HO-1可調(diào)節(jié)血紅素分解代謝過程，是其限速酶之一，細胞通過在線粒體募集HO-1，可啟動線粒體自噬過程，參與線粒體的調(diào)節(jié)[35]。通過給予不同濃度LPS以建立膿毒癥ALI模型，發(fā)現(xiàn)隨著LPS濃度升高，肺上皮細胞中胞p-RIP3、RIPK1、p-MLKL、TNF-α、PINK1、Drp1、LC3B蛋白相對表達水平均升高,線粒體膜電位降低，提示LPS可導(dǎo)致肺上皮細胞壞死性凋亡，并激活線粒體自噬。同時，HO-1誘導(dǎo)并激活線粒體自噬的動態(tài)過程，使得Mfn2、OPA1、Drp1增加，并在mRNA和蛋白質(zhì)水平促進了線粒體自噬的關(guān)鍵介質(zhì)(Parkin、PINK1)的生成[36]。

3 Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬在急性肺損傷中的作用

在體內(nèi)實驗和體外實驗中，應(yīng)用脂多糖(LPS)均可誘導(dǎo)產(chǎn)生急性肺損傷ALI，而線粒體自噬在ALI的不同階段可以發(fā)揮著不同的作用。在早期階段，細胞死亡主要由自噬引起，這種情況在傷后2 h達到峰值;隨著ALI進展,肺組織細胞中自噬逐漸下調(diào)而調(diào)亡逐漸上調(diào)[37]。骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)通過PINK1/parkin信號通路增強自噬，導(dǎo)致線粒體裂變蛋白DRP1和其他DAMP途徑介質(zhì)(如S100A4和S100A8、HMGB1、RAGE和AGE)顯著增加，受損的線粒體及線粒體碎片得到清除，同時mfn1、mfn2和opa1等融合基因的表達得到增加，最終減少了ALI時肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷，起到保護肺泡上皮細胞的作用[38]。線粒體自噬在氯氣誘發(fā)的ALI反應(yīng)過程中發(fā)揮了保護性作用,將NCI-H441(人肺腺癌上皮)細胞暴露于氯氣中，作用1 h后，細胞生物能功能和線粒體膜電位下降。用線粒體氧化還原調(diào)節(jié)劑MitoQ治療可減輕這些生物能缺陷；暴露后6 h，自噬顯著增加。NCI-H441細胞用自噬激活劑海藻糖預(yù)處理后，再暴露于氯氣作用，其細胞的功能得到改善，而使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤進行預(yù)處理，可導(dǎo)致細胞功能障礙增加，表明線粒體自噬在體外可發(fā)揮保護作用[39]。

而在機械通氣中，線粒體自噬對肺部功能的作用則截然相反。大潮氣量通氣可以快速激活肺泡Ⅱ型上皮細胞自噬，選擇性沉默肺泡Ⅱ型上皮細胞Atg5基因,可以增加機械通氣誘發(fā)的NLRP3炎癥小體活化及肺損傷。由此可見，抑制肺泡Ⅱ型上皮細胞線粒體自噬活化,會加重機械通氣相關(guān)ALI[40]。與此相反，在高氧誘導(dǎo)的急性肺損傷中，大鼠的肺miR-21-5p水平顯著降低，miR-21-5p通過與靶基因PGAM5直接結(jié)合，抑制線粒體自噬和線粒體功能障礙，反而可以改善高氧誘導(dǎo)的急性肺損傷。而過度激活的線粒體自噬，則加重肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷[41]。

4 小結(jié)

ALI是臨床常見的急危重癥，機體通過產(chǎn)生ROS 和減少ATP 釋放引起線粒體功能障礙，加重病情進展。作為一種保護性誘導(dǎo)過程，在肺泡Ⅱ型上皮細胞中適度激活線粒體自噬，可通過抑制炎性反應(yīng)，有效保護肺功能，為ALI的治療提供新的思路。但目前關(guān)于Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的研究主要集中在針對肺巨噬細胞，對肺泡Ⅱ型上皮細胞的研究較少，且Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在急性肺損傷中的作用存在也不同的觀點。線粒體自噬是一個動態(tài)過程，在單一靜態(tài)時間點評估Pink1/Parkin的表達可能會產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果，調(diào)控其適度激活具有一定難度，且因此未來需對線粒體自噬進行全面評估，以把控急性肺損傷中肺泡Ⅱ型上皮細胞線粒體自噬的激活程度，從而對急性肺損傷的治療提供指導(dǎo)。