孫超男，梁家齊，于昊彤，熱依萊，楊 珂，魏千皓，趙 剛

(吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 國家衛(wèi)生健康委員會放射生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，吉林 長春 130021)

1 靶向腫瘤的高劑量放療免疫調(diào)節(jié)作用有限

免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICB)如：細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4)、程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(PD-1)及其配體(PD-L1)抗體在臨床取得成功，引起腫瘤免疫治療研究的熱潮。然而，只有不到50%的癌癥患者適用于這種免疫療法，在適用于這種療法的患者中，也只有不到50%的患者真正從中受益[1]。腫瘤突變負(fù)荷低，腫瘤局部T細(xì)胞浸潤程度低，是導(dǎo)致ICB無法發(fā)揮作用的最常見因素[2-3]。因此，腫瘤免疫治療取得成功的關(guān)鍵是增加T淋巴細(xì)胞在腫瘤局部的浸潤。為了增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的療效，目前常規(guī)的做法是高劑量腫瘤局部單次外照射與免疫治療聯(lián)合應(yīng)用。這樣做的理論依據(jù)是大劑量局部單次外照射起到腫瘤局部“原位疫苗接種”的效果，這種“原位疫苗接種”效應(yīng)會進(jìn)一步誘發(fā)“遠(yuǎn)端效應(yīng)”，“遠(yuǎn)端效應(yīng)”主要指局部放療觸發(fā)全身抗腫瘤作用，誘導(dǎo)遠(yuǎn)處非靶向腫瘤消退[4]。但是，在實際臨床應(yīng)用中，高劑量腫瘤局部單次外照射與免疫治療聯(lián)合應(yīng)用誘發(fā)的這種遠(yuǎn)端效應(yīng)較為罕見[5]。這種單次腫瘤局部高劑量照射能夠改變非靶其他部位腫瘤微環(huán)境的想法未免不切實際，因為腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞和其周圍的宿主細(xì)胞相互作用共同決定的，是受到宿主周圍癌旁組織和正常組織的遺傳背景和分子狀態(tài)影響的[6-7]。雖然單次照射的“腫瘤疫苗原位接種”的概念可能沒有錯，但是臨床上眾多的腫瘤疫苗的失敗表明，要想消滅腫瘤，除了誘發(fā)機(jī)體的系統(tǒng)抗腫瘤免疫反應(yīng)外，還必須改變腫瘤微環(huán)境(TME)[8]。而且單次大劑量照射的毒副作用和誘發(fā)的免疫抑制作用，都限制了其應(yīng)用。研究表明，小劑量照射(這里指<3 Gy的劑量)可以激發(fā)機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫，從而有利于后續(xù)的免疫治療的進(jìn)行[9-11]，本文對其進(jìn)行簡要綜述。

2 低劑量放射性核素與ICB的聯(lián)合應(yīng)用抗瘤效果明顯

Patel等[9]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用放射性核素90Y-NM600與ICB聯(lián)合應(yīng)用，在治療B78黑色素瘤小鼠模型中發(fā)揮了良好的抗瘤效果，即低劑量靶“向放射性核素治療聯(lián)合ICB可提高臨床前腫瘤模型的完全緩解率”。該研究中的NM600是一種治療性烷基磷酸膽堿類似物，優(yōu)先積累在幾乎所有的腫瘤類型中。NM600螯合放射性同位素釔90，即90Y-NM600半選擇性地將其傳遞到TME，用于腫瘤的治療或診斷。釔90發(fā)射的是β射線，在體內(nèi)的照射半徑是3.9 mm。釔90所發(fā)出的β射線幾乎全部被周圍的腫瘤組織所吸收，對臨近的骨髓、脾臟和周圍淋巴結(jié)的影響很小。臨床前動物實驗表明，90Y-NM600在生物學(xué)分布、腫瘤選擇性等方面都是安全的，適合人類應(yīng)用，相關(guān)的更嚴(yán)格的臨床測試還在進(jìn)行當(dāng)中[10]。作者所測試的劑量范圍為0～5 Gy內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)，低劑量(<2.5 Gy)靶向放射性核素對腫瘤局部的照射，可明顯增加腫瘤局部髓性淋巴細(xì)胞CD11b+和NK細(xì)胞的浸潤，并上調(diào)了CD8+/CD4+CD25+FOXP3+的比值，從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對隨后ICB治療的反應(yīng)。

該研究顯示2.5 Gy的90Y-NM600發(fā)揮了良好的抗B78黑色素瘤的效果，這種局部低劑量內(nèi)照射使TME發(fā)生了免疫重編程，上調(diào)Ⅰ型干擾素(IFN)的表達(dá)，這種作用依賴于照射后激活的STING[cGMP-AMP (cGAMP) synthase (cGAS)/stimulator of interferon genes]通路，表現(xiàn)在敲除了STING通路的小鼠(Tmem173-/-)，治療作用也隨之消失。通過高緯度表型流式細(xì)胞術(shù)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析也證明，低劑量內(nèi)照射使TME中的免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生重編程。與釔90半衰期是2.5 d這個規(guī)律相吻合，這種變化的效果是短暫的，于引入釔90內(nèi)照射14 d后重返照射前的基準(zhǔn)水平。在隨后的實驗中，90Y-NM600與ICB制劑CTLA-4單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用，與90Y-NM600或CTLA-4單獨(dú)應(yīng)用相比，流式細(xì)胞術(shù)和T細(xì)胞表面受體(TCR)測序都證明聯(lián)合應(yīng)用顯著提高了CD8+T細(xì)胞的總量、TME中的記憶性T細(xì)胞和先天γδT細(xì)胞，同時，CD8+T表現(xiàn)出更強(qiáng)的克隆擴(kuò)增性和更少的功能衰竭性。與單獨(dú)治療相比，聯(lián)合治療也顯著提高了荷瘤鼠的生存率和生存時間。進(jìn)一步的研究證實，在90Y-NM600與ICB聯(lián)合應(yīng)用的基礎(chǔ)上，再加入單次大劑量腫瘤局部外照射(12 Gy)，其抗瘤效果更佳，并容易誘發(fā)“遠(yuǎn)端效應(yīng)”，其抗瘤效果優(yōu)于任何一項或兩項單獨(dú)使用。此外，在聯(lián)合治療后獲得長期腫瘤清除的小鼠產(chǎn)生了保護(hù)性免疫記憶。因此推測，90Y-NM600的低劑量內(nèi)照射和單次大劑量外照射之間起到一個互補(bǔ)作用，從而進(jìn)一步增強(qiáng)了腫瘤對ICB的反應(yīng)，收到了良好的抗瘤效果。

總之，該研究顯示，低劑量靶向核素內(nèi)照射可使TME發(fā)生免疫重編程，并將“冷腫瘤”轉(zhuǎn)化為免疫反應(yīng)性和ICB反應(yīng)性腫瘤。這些發(fā)現(xiàn)為低劑量靶向核素內(nèi)照射聯(lián)合ICB治療“冷腫瘤”的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

3 低劑量外照射與ICB聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤效果明顯

有研究者把低劑量外照射與ICB聯(lián)合應(yīng)用于ID8上皮卵巢癌小鼠模型的治療中[11]。通常，人類上皮卵巢癌對ICB治療是抗拒的，因為卵巢癌組織內(nèi)T細(xì)胞浸潤太少[12]。研究者用0.5～2 Gy劑量外照射小鼠整個腹部，結(jié)果顯示1 Gy照射的效果最佳，體現(xiàn)在“冷腫瘤”浸潤了更多的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞和NK細(xì)胞，并且CD8+/Treg 細(xì)胞比值也最高。這種低劑量腹部外照射，目的是使TME發(fā)生了免疫重編程，促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤，而不是直接殺滅腫瘤細(xì)胞。這種低劑量照射的效果是短暫的，1 w后消失，T細(xì)胞浸潤恢復(fù)到照射前水平。然而，如果重復(fù)1 Gy/(次·w)，這種T細(xì)胞浸潤的效果就能夠持續(xù)。更重要的是，研究者發(fā)現(xiàn)，在1 Gy照射后第5天，免疫治療的靶基因開始上調(diào)，這些基因包括共抑制性T細(xì)胞受體PD-1和CTLA-4，Treg細(xì)胞表面的FOXP3，抗原遞呈細(xì)胞表面的CD40受體。這些發(fā)現(xiàn)提示，可以設(shè)計一種更全面的聯(lián)合治療方案，包括ICB使T細(xì)胞抗瘤作用更強(qiáng)，CD40配體刺激抗原遞呈細(xì)胞和低劑量環(huán)磷酰胺減弱Treg細(xì)胞。研究者展開了一個為期3 w的這種聯(lián)合治療方案，這種方案包括：1 Gy外照射，包括整個腹部；抗PD-1和CTLA-4的抗體；CD40受體激動劑和低劑量的環(huán)磷酰胺，作者稱之為RACIM(radio-combinatorial immunotherapy)。這種聯(lián)合治療的腫瘤反應(yīng)率為83.5%，治愈率為15.0%，而其他方案對這種卵巢癌的治療是無效的。反褶積實驗(不含其中一種成分的RACIM)證實，“雞尾酒”中的所有成分都是生存獲益所必需的，去掉其中任何一種，都達(dá)不到理想的抗瘤效果。

RACIM治療可增加腫瘤局部浸潤淋巴細(xì)胞中的TCF1- PD-1+、CD4+和CD8+的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，并高表達(dá)γ-IFN，顆粒酶B和穿孔素。RACIM也誘導(dǎo)出兩個新的樹突細(xì)胞亞群cDC2(conventional DCs type2)和MoDCs(monocyte-like DCs)，這兩個亞群都高表達(dá)NKG2D(NK group 2D)配體RAE1[13]。此外，在RACIM治療的腫瘤中，具有衰竭表型的CD4+和CD8+腫瘤局部浸潤T細(xì)胞上調(diào)了NKG2D共刺激因子受體。這些表現(xiàn)都是相互關(guān)聯(lián)的，因為這些表達(dá)NKG2D共刺激因子受體的腫瘤局部浸潤T細(xì)胞定義了一個具有高效應(yīng)和增殖能力的典型的衰竭表型T細(xì)胞子集。實驗證實，如果用抗體封閉了NKG2D，RACIM的治療作用也就消失了。進(jìn)一步實驗證實，如果用Fingolimod(FTY720)抑制了T淋巴細(xì)胞從周圍淋巴結(jié)的遷移，RACIM的作用也消失，表現(xiàn)在小鼠生存率下降，這個實驗證明，RACIM發(fā)揮作用依賴于T淋巴細(xì)胞從周圍淋巴結(jié)向腫瘤周圍的遷移和聚集。

4 低劑量外照射使處于免疫沙漠型腫瘤發(fā)生免疫重編程從而有利于ICB的抗腫瘤作用

研究者在動物實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展了臨床一期觀察(NCT0378179)[11]：研究者制定了嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn)，共觀察了8例患者，包括轉(zhuǎn)移性卵巢癌、前列腺癌、膽囊癌和結(jié)腸癌，他們的腫瘤經(jīng)診斷都屬于免疫沙漠型腫瘤。具體的聯(lián)合給藥方案為：低劑量外照射整個腹部(0.5或1 Gy/次，共2 w，連續(xù)照射，中間停1 d，總劑量為6或13 Gy)，低劑量環(huán)磷酰胺，ipilimumab，nivolumab和阿司匹林，其中ipilimumab和nivolumab為ICB上市藥物，分別是針對PD-1和CTLA-4的中和抗體。研究者稱此方案的為RACIN(Radiation,Aspirin,Cyclophosphamide,Ipilimumab,Nivolumab)。經(jīng)過1個療程治療后，這8例患者中的3例，經(jīng)CT或PETS-CT診斷，照射野范圍內(nèi)腫瘤完全消除，4例照射野范圍內(nèi)腫瘤縮小，只有1例無反應(yīng)，繼續(xù)長大。大于3級的免疫相關(guān)不良事件的發(fā)生率為25%，包括大腸炎、肝炎和心肌炎。與前期動物實驗相似，GeoMx空間轉(zhuǎn)錄譜分析證實，RACIN治療導(dǎo)致TME周圍CD4+、Th1、CD8+和效應(yīng)性記憶T淋巴細(xì)胞聚集增多。與此相反，那1例治療效果不好的病例中，TME周圍的這些細(xì)胞聚集沒有變化，而抗炎型M2巨噬細(xì)胞卻增多。在治療效果良好的那7例患者中，低劑量照射野范圍內(nèi)的腫瘤都消退或者消失了，而照射野外的轉(zhuǎn)移瘤卻并未有反應(yīng)。這個結(jié)果表明，低劑量照射增強(qiáng)ICB的效果不是依賴于“遠(yuǎn)端效應(yīng)”，而是低劑量照射對TME直接改變的結(jié)果。進(jìn)一步推測，局部外照射改變了TME中的免疫環(huán)境，發(fā)生了免疫重編程，從而有利于后續(xù)的ICB治療清除腫瘤，盡管具體的細(xì)節(jié)還不清楚。這項研究最值得關(guān)注的點(diǎn)就是，TME的免疫重編程只局限于低劑量照射野范圍內(nèi)，而照射野范圍外并無此效應(yīng)。

動物實驗和人體實驗的結(jié)果都表明，低劑量外照射可以安全應(yīng)用于實體瘤，多發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤治療，使TME中的免疫細(xì)胞發(fā)生免疫重編程，使處于免疫沙漠型的“冷腫瘤”轉(zhuǎn)化為免疫反應(yīng)型的“熱腫瘤”，從而有利于后續(xù)ICB的治療。

5 低劑量外照射可以改變腫瘤的免疫抑制微環(huán)境

研究表明[14]，用大劑量照射一處較大腫瘤(12 Gy/次，共3次)，結(jié)合低劑量照射多處較小的繼發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤(1 Gy/次，共2次)和ICB治療129Sv/Ev小鼠的344SQ-P肺癌。結(jié)果顯示，低劑量照射使TME周圍的巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，并降低起免疫抑制作用的轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β含量，與單次大劑量照射和ICB結(jié)合，收到了良好的抗瘤效果。抗腫瘤作用依賴于固有免疫和獲得性免疫的綜合作用，特別是NK細(xì)胞、CD4+和CD8+的T淋巴細(xì)胞。研究者在動物實驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了臨床一期的觀察(NCT02710253)，入選共8例患者，是對常規(guī)的ICB治療抗拒，包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、鼻咽癌、間變性甲狀腺癌、默克爾細(xì)胞癌、唾液腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤，聯(lián)合治療方案包括大劑量照射、低劑量照射和ICB治療。臨床結(jié)果顯示，這種聯(lián)合治療方案安全有效。入選的8例患者中有5例效果明顯。特別值得注意的是其中1例多轉(zhuǎn)移性口咽鱗狀細(xì)胞癌，經(jīng)聯(lián)合治療6個月后，腫瘤幾乎完全消失。另1例黑色瘤患者的腫瘤也是幾乎完全消失。這些令人鼓舞的臨床前和臨床數(shù)據(jù)表明，低劑量大面積照射轉(zhuǎn)移瘤，可增強(qiáng)后續(xù)局部大劑量照射對腫瘤的直接殺傷作用和“遠(yuǎn)端效應(yīng)”，增強(qiáng)ICB的治療作用，低劑量照射在腫瘤治療中可能發(fā)揮重要輔助作用，使那些對傳統(tǒng)ICB治療抗拒的腫瘤患者獲得新生。

6 總結(jié)與展望

以上臨床前和臨床試驗數(shù)據(jù)充分說明，低劑量照射在治療轉(zhuǎn)移瘤中的重要作用[9,11,14]。這種重要作用體現(xiàn)在低劑量照射促進(jìn)T細(xì)胞向腫瘤局部浸潤，使免疫抑制型M2型巨噬細(xì)胞向抗腫瘤型M1轉(zhuǎn)化，使腫瘤局部脈管系統(tǒng)恢復(fù)正常，促進(jìn)T細(xì)胞歸巢和活化，增殖，最終分化為效應(yīng)性T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。

低劑量照射全部可見的轉(zhuǎn)移瘤病灶，可使“冷腫瘤”的固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)都調(diào)動起來，并阻止了免疫抑制途徑，低劑量照射適合與ICB聯(lián)合應(yīng)用。證明傳統(tǒng)的單次大劑量照射完全可以和低劑量照射相結(jié)合，發(fā)揮各自的互補(bǔ)作用，使單次大劑量照射的“遠(yuǎn)端效應(yīng)”發(fā)生的概率增加[9，11，14]。

低劑量靶向放射性核素治療與低劑量外照射相比，有顯著的優(yōu)勢，即低劑量靶向放射性核素可以沉積在一些影像學(xué)尚無法辨別的微小腫瘤組織內(nèi)發(fā)揮作用。因此未來的研究方向是開發(fā)更多種類、品質(zhì)更好的低劑量放射性核素，例如那些已經(jīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的，如發(fā)射α射線的鐳223和發(fā)射β射線的镥177，是否可以靶向腫瘤局部和ICB聯(lián)合發(fā)揮抗腫瘤作用。另外，高劑量照射誘發(fā)的腫瘤本身的免疫抑制作用是否同樣會發(fā)生在低劑量照射與ICB聯(lián)合治療中，這些問題都是有待探討的關(guān)鍵點(diǎn)。未來的工作中，還需要明確針對不同腫瘤，小劑量的范圍以及照射的時間和順序，小劑量照射的最大耐受劑量或者最多耐受次數(shù)也需要探索，究竟哪種ICB藥物最適合與小劑量照射聯(lián)合應(yīng)用，藥物的用量和用藥順序等等一系列的問題，均有待于深入研究和探索。