陳 利,侯秀云,張國(guó)波,孫燕俠,張 薇,劉建民,蔡志雄,吳偉東,王 健

[遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院小兒外科，廣東 珠海 519100]

在小兒骨科領(lǐng)域，有許多復(fù)雜的先天性肢體畸形，矯治過程中由于大段骨缺損需要各種修復(fù)材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的重建。骨髓炎清創(chuàng)、嚴(yán)重創(chuàng)傷、巨大骨腫瘤切除術(shù)等，均易導(dǎo)致兒童肢體大段骨缺損，進(jìn)而導(dǎo)致肢體遺留殘疾。嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育和身心健康，給患兒家庭以及社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)[1]。用何種材料修復(fù)較大范圍的骨缺損一直是臨床醫(yī)生思考的問題。目前對(duì)缺損的修復(fù)多采用自體骨移植，效果滿意。但自體骨移植必須從健康部位切取骨組織修復(fù)病損部位，增加創(chuàng)傷，對(duì)供區(qū)造成新的骨缺損，且由于兒童體型較小，軟骨較多，還需考慮兒童發(fā)育等因素，自體骨組織供區(qū)十分有限[2]。因此，對(duì)于較大面積的骨缺損，尋找一種安全、可靠的人工材料來替代自體骨移植就顯得尤為重要。本研究通過制作不同比例絲素蛋白復(fù)合脫鈣骨基質(zhì)作為骨修復(fù)材料對(duì)幼兔骨缺損模型進(jìn)行修復(fù)，通過生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察，探討該復(fù)合材料的力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)特征。

1 材料和方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3月齡健康、清潔級(jí)新西蘭幼兔54只，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg，由遵義醫(yī)科大學(xué)(珠海校區(qū))動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.1.2主要儀器：①深低溫冰箱，日本三洋公司；②粉碎機(jī)，青島NDD公司；③手術(shù)器械，上海醫(yī)療器械公司；④恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋公司；⑤超純水裝置，天津龍川公司；⑥線鋸，德國(guó)；⑦高壓滅菌鍋，上海申安；⑧離心機(jī)，德國(guó)西格瑪；⑨X攝片機(jī)，美國(guó)GE公司；⑩AE電子天平，瑞士mettler toledo公司；石蠟包埋機(jī)，德國(guó)萊卡公司；石蠟切片機(jī)，德國(guó)萊卡公司；顯微鏡BX50，奧林巴斯；數(shù)碼成像系統(tǒng)DP50，奧林巴斯。

1.1.3主要試劑：①戊巴比妥鈉，美國(guó)Sigma；②碳酸鈉試劑，北京化學(xué)試劑廠；③氯化鈣試劑，北京化學(xué)試劑廠；④鹽酸(37%)，北京益利精細(xì)化學(xué)品試公司；⑤無(wú)水乙醚，北京益利精細(xì)化學(xué)品試公司；⑥六氟異丙醇，濟(jì)南凱化化工公司；⑦蘇木素，北京化學(xué)試劑廠；⑧伊紅，北京化學(xué)試劑廠；⑨改良Masson三色染色試劑盒，北京Leagene公司；⑩Anti-Osteocalci抗體(鼠)，Abcam公司；Anti-CollagenⅠ抗體(兔)，Abcam公司；免疫組化檢測(cè)試劑盒SP-9001 (兔)，中杉金橋；免疫組化檢測(cè)試劑盒SP-9002 (鼠)，中杉金橋；DAB顯色試劑盒ZLI-9018，中杉金橋；EDTA液，北京化學(xué)試劑公司；PBS緩沖液，美國(guó)Amresco公司；乙酸，北京益利精細(xì)化學(xué)品試公司；甲酸，北京益利精細(xì)化學(xué)品試公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1絲素蛋白DBM復(fù)合物的制備：將家養(yǎng)蠶絲置于97℃ Na2CO3(0.1%溶液)中，設(shè)定28 min 3次，37℃晾干后，用CaCl2-CH2CH2OHH2O溶液將其溶解(摩爾比為1∶2∶8)，用雙蒸水透析并將其凍干。DBM制備：選取3月齡健康新西蘭幼兔12只，耳緣靜脈推注空氣處死,取雙側(cè)尺橈骨骨干皮質(zhì)骨塊，經(jīng)-80℃深低溫冷凍,利用粉碎機(jī)粉碎形成顆粒狀，反復(fù)粉碎并篩選小于200 μm的顆粒物;經(jīng)C4H10O(脫脂)、HCl(脫鈣)處理后凍干,最后利用輻照滅菌備用。

1.2.2絲素蛋白復(fù)合DBM骨修復(fù)材料的制備:將凍干的絲素蛋白加入六氟異丙醇與絲素蛋白混合溶解;再加入已篩選好的DBM顆粒(200 μm)，將SF和DBM以DBM占復(fù)合物總體積的一定比例(0%、10%、20%、40%、80%)混合;將混合物置入模具中固化，得到不同比例的SF與DBM復(fù)合材料備用。

1.2.3橈骨缺損模型的建立及復(fù)合材料修復(fù):選取3月齡健康、清潔級(jí)雄性新西蘭幼兔42只，體重2.0～2.5 kg，由遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。應(yīng)用隨機(jī)抽簽法將其分為7組分別放入A、B、C、D、E、F、G籠，每組6只。均在右側(cè)前臂行橈骨缺損手術(shù)建立骨缺損幼兔模型。建模成功后，A組為植入0%DBM組；B組為植入10%DBM組；C組為植入20%DBM組；D組為植入40%DBM組；E組為植入80%DBM組。F組為自體骨移植組，該組幼兔取骨缺損模型造模時(shí)截取的骨組織原位移植。G組空白對(duì)照組僅做骨缺損造模后不做任何處理，直接縫合切口。術(shù)后第2周、第4周、第8周分別于各組取4只幼兔進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.4手術(shù)操作:將各組幼兔稱重后麻醉(3%的戊巴比妥鈉1.0 ml/kg耳緣靜脈注射),麻醉成功后,仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，有前臂備皮后消毒、鋪無(wú)菌單，取右前臂橈側(cè)切口，彎鉗鈍性分離肌間隙顯露橈骨中段，無(wú)菌軟尺測(cè)量15 mm缺損長(zhǎng)度,手術(shù)刀標(biāo)記兩端截骨點(diǎn),用線鋸將橈骨中段造成15 mm骨段骨缺損(包括骨膜)，切除尺橈骨骨間膜，同時(shí)剝離缺損近端5 mm骨膜,0.9% NaCl溶液沖洗三遍,確定斷端無(wú)骨碎片和軟組織后，A～E組將提前制備好的不同比例SF復(fù)合DBM修復(fù)材料植入對(duì)應(yīng)分組的幼兔橈骨缺損處(A組為植入0%DBM組；B組為植入10%DBM組；C組為植入20%DBM組；D組為植入40%DBM組；E組為植入80%DBM組),再次消毒并縫合切口，F(xiàn)組(自體骨移植組)將骨缺損取出的骨組織以咬骨鉗咬成碎塊后原位移植于骨缺損處，消毒并縫合切口。G組(空白對(duì)照組)做截骨骨缺損模型后不做任何處理，直接縫合切口。所有實(shí)驗(yàn)組幼兔術(shù)后連續(xù)3 d每天肌內(nèi)注射青霉素50 kU，術(shù)后不固定患肢，分籠單獨(dú)喂養(yǎng)，自由進(jìn)食。

1.3觀察項(xiàng)目

1.3.1大體觀察:術(shù)后觀察幼兔精神狀態(tài)、飲食活動(dòng)、手術(shù)區(qū)有無(wú)紅腫及膿性分泌物等并記錄。于術(shù)后第2周、第4周、第8周隨機(jī)將每組幼兔選取2只處死。處死幼兔后由原切口切開并剝離骨膜，切取右橈骨大體標(biāo)本。觀察絲素蛋白復(fù)合DBM材料與周圍組織粘連及骨缺損端與該復(fù)合，按照Hitchcock粘連分級(jí)進(jìn)行評(píng)分。

1.3.2X線檢測(cè)：術(shù)后第2周、第4周、第8周對(duì)各組幼兔進(jìn)行線檢查(曝光條件50 kV，90 mA，1.0 S),觀察骨缺損區(qū)域骨形成情況，并采用Lane-sandhuX線評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.3成骨分化標(biāo)志基因(Osteocalcin，CollagenⅠ)的檢測(cè)：所有骨標(biāo)本組織切片，乙醇(80%～100%)進(jìn)行脫水后，滲透，包埋。然后將標(biāo)本垂直于短軸鋸成100～200 μm厚的切片，然后手工磨片，最后完成的切片厚度 30～50 μm。骨組織切片常規(guī)脫蠟水化后，蘇木素溶液染色1 min，流水沖洗5 min；切片浸入1%鹽酸酒精溶液分化10 s，流水沖洗至在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞核呈藍(lán)色為止；醇溶伊紅溶液染色2 min; 常規(guī)步驟脫水透明、封片，于顯微鏡下觀察。骨組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，去離子水洗3次，5 min/次。將切片置0.01 mol/L枸櫞酸鹽溶液(pH值=6.0)，于60℃水浴過夜孵育(12 h)，進(jìn)行抗原修復(fù)。次日取出切片，自然冷卻至室溫。PBS沖洗3次，5 min/次。使用3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育10 min。PBS洗次，5 min/次。滴加5%正常山羊血清于37℃敷箱孵育1 h。甩去封閉液，滴加骨鈣素或一型膠原一抗溶液(1∶100)，于4℃過夜孵育。PBS洗3次，5 min/次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液，37℃孵育1 h。PBS洗3次5 min/次。滴加現(xiàn)配的DAB顯色液，于顯微鏡下觀察染色狀態(tài)，及時(shí)終止。自來水沖洗5 min。蘇木素染液染色1 min。1%鹽酸酒精分化10 s，水洗5 min。常規(guī)脫水透明，用中性樹脂封片后觀察骨小梁表面成骨細(xì)胞數(shù)量變化。

2 結(jié)果

2.1大體觀察:術(shù)后幼兔無(wú)死亡，活動(dòng)正常，術(shù)后10～14 d，所有幼兔傷口均愈合，無(wú)明顯感染情況。分別處死各組幼兔，沿原手術(shù)切口切開皮膚暴露手術(shù)區(qū)域，通過大體觀察評(píng)估粘連情況。術(shù)后2 w：A組、B組、C組、D組、E組、F組幼兔試驗(yàn)區(qū)域骨組織與絲素蛋白復(fù)合材料均有輕度粘連，并見到骨痂生長(zhǎng)。植入材料均被纖維骨痂包裹粘連，骨缺損斷端有少量骨纖維連接，與周圍組織輕度粘連，較容易分開。G組骨缺損除未見骨痂生長(zhǎng)，骨缺損斷端無(wú)骨纖維連接，斷端分離。術(shù)后4 w：A組、B組、C組、D組、E組幼兔骨缺損處與周圍組織粘連緊密，需借助手術(shù)器械分離，見骨痂生長(zhǎng)，F(xiàn)組骨痂生長(zhǎng)優(yōu)于D組，D組優(yōu)于A組、B組、C組、E組，G組骨缺損斷端骨髓腔消失，仍未見骨痂連接。術(shù)后8 w：各組均可見新生骨與周圍組織嚴(yán)重粘連，F(xiàn)組幼兔骨缺損區(qū)域見類骨樣增生，缺損區(qū)被大量新生骨填充，與周圍組織粘連緊密。G組骨缺損兩端與周圍組織粘連，缺損兩端形成假關(guān)節(jié)，無(wú)纖維性連接。根據(jù)Hitchcock粘連程度分級(jí)方法，對(duì)以上各組粘連程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果：2 w內(nèi)各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，4 w和8 w A組、B組、C組、D組、E組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與F組、G組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組Hitchcock粘連程度計(jì)數(shù)(n，n=6)

2.2X線檢查結(jié)果與分析：分別在術(shù)后第2周、第4周、第8周處死幼兔，仰臥位，右前臂外展位拍攝正位片觀察。術(shù)后2 w：植入絲素蛋白復(fù)合脫鈣骨基質(zhì)的A組、B組、C組、D組、E組手術(shù)區(qū)域骨缺損明顯，植入材料未顯影，缺損兩端可見少量骨痂生長(zhǎng)，F(xiàn)組見骨痂生長(zhǎng)較A組、B組、C組、D組、E組稍多，G組未見明顯骨痂生長(zhǎng)。術(shù)后4 w：植入復(fù)合材料的A組、B組、C組、D組、E組骨缺損面積較2 w時(shí)明顯減小，其中A組、B組見少量新骨形成，骨髓腔未見，塑型差；C組、D組、E組、F組見較多新骨和骨痂，D組、F組見骨髓腔形成；G組見少量骨痂形成。術(shù)后8 w：植入復(fù)合材料的各組骨缺損區(qū)與4 w時(shí)對(duì)比明顯縮小。D組、F組骨缺損區(qū)域被新骨和骨痂完全填充，并可見骨皮質(zhì)塑型，骨折線模糊。A組、B組、C組、E組骨痂和新骨形成較D組、F組少，骨折線可見。G組較4 w時(shí)無(wú)明顯變化。見表2。

表2 各組Lane-sandhuX線評(píng)分

2.3HE染色：術(shù)后2 w：各組植入復(fù)合材料均出現(xiàn)部分分解吸收，A組見復(fù)合材料周圍少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。斷端見成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，骨缺損處無(wú)明顯成骨；B組見植入材料周圍少量孔隙，孔隙內(nèi)見肉芽組織生長(zhǎng)，周圍可見少量骨質(zhì)形成，斷端見軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞；C組、E組見植入材料吸收比A組、B組稍明顯，周圍見少量骨質(zhì)形成，斷端見新骨生長(zhǎng)。D組、F組植入材料與周圍組織空隙小，見塊狀骨質(zhì)形成，周圍見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，斷端見軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞較多，并見到肉芽組織往植入材料孔隙中生長(zhǎng)。G組見斷端少量骨樣組織形成。

術(shù)后4 w：各組植入復(fù)合材料較前進(jìn)一步分解，斷端見新生骨，復(fù)合材料內(nèi)見肉芽組織生長(zhǎng)，復(fù)合材料與周圍組織緊密粘連，周圍見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。A組復(fù)合材料周圍見較多軟骨細(xì)胞。B組復(fù)合材料與周圍組織之間存在空隙，周圍見骨樣組織形成。C組見復(fù)合材料周圍較多新骨形成；D組見復(fù)合組織與周圍組織粘連緊密，材料周圍見較多骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞形成。E組與2 w時(shí)比較無(wú)明顯變化；F組見復(fù)合材料周圍較多骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)；G組斷端有松質(zhì)骨形成連接。

術(shù)后8 w：各組植入復(fù)合材料分解較4 w時(shí)增加，斷端新骨形成增多，復(fù)合材料內(nèi)均見到肉芽組織生長(zhǎng)。A組復(fù)合材料與周圍組織之間可見少量間隙，周圍見成骨細(xì)胞和炎性細(xì)胞；B組復(fù)合材料周圍見骨質(zhì)形成，見少量軟骨細(xì)胞；C組見材料和周圍組織緊密包繞生長(zhǎng)，周圍新骨較前增多；D組材料周圍見較多骨細(xì)胞生長(zhǎng)；E組材料和周圍組織之間少量空隙，見較多成骨細(xì)胞和少量炎性細(xì)胞；F組和D組相識(shí)，見較多新骨形成；G組斷端見新骨形成，但未形成骨性連接。

2.4Osteocalci免疫組化結(jié)果分析：術(shù)后2 w：A組、B組、G組未見陽(yáng)性顆粒，C組見少量陽(yáng)性顆粒；D組、E組、F組陽(yáng)性顆粒相似，均比C組多；G組未見明顯陽(yáng)性顆粒。術(shù)后4 w：A組、B組均見少量陽(yáng)性顆粒出現(xiàn)，兩組相似；C組陽(yáng)性顆粒較2 w時(shí)增多；D組、E組、F組陽(yáng)性顆粒較前增多，分布面積較前擴(kuò)大；G組仍未見陽(yáng)性顆粒。術(shù)后8 w：A～F組材料周圍均可見陽(yáng)性顆粒，與4 w相比無(wú)明顯增多，G組斷端未見明顯陽(yáng)性顆粒。通過上述結(jié)果觀察，所有實(shí)驗(yàn)組骨鈣素在4 w時(shí)分泌最旺盛。經(jīng)比較D組、F組分泌骨鈣素多于其他組(P<0.05)。見表3。

表3 Osteocalci免疫組化結(jié)果

2.5Collagen Ⅰ免疫組化結(jié)果:術(shù)后第2周：A組、B組、C組、D組、E組、F組實(shí)驗(yàn)標(biāo)本材料均可檢測(cè)到不同面積的陽(yáng)性顆粒。G組未見明顯陽(yáng)性顆粒。術(shù)后第4周：試驗(yàn)各組檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性顆粒面積較前明顯增大，其中D組、F組陽(yáng)性顆粒面積最大，D組、F組>E組>C組>A組>B組，G組陽(yáng)性顆粒仍然不明顯。術(shù)后第8周：A組陽(yáng)性顆粒面積和第4周時(shí)相似，B組陽(yáng)性顆粒面積較第4周時(shí)增加。C組、D組、E組、F組陽(yáng)性顆粒面積較第4周略減少。但D組、F組陽(yáng)性顆粒仍最多。G組斷端陽(yáng)性顆粒不明顯。根據(jù)上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果，CollagenⅠ陽(yáng)性表達(dá)主要發(fā)生在第4周和第8周，將具體數(shù)據(jù)應(yīng)用非參數(shù)軼和檢驗(yàn)進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示D組、F組較其余實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生CollagenⅠ更多。見表4。

表4 各組Collagen Ⅰ免疫組化結(jié)果比較

3 討論

目前臨床上治療大面積骨缺損最佳的治療方法為自體骨移植。但由于供區(qū)有限和供區(qū)二次創(chuàng)傷等問題，不容易被患者和家屬接受。而異體骨移植和同種異體骨移植主要來源于動(dòng)物和人骨制品。雖來源廣泛，但術(shù)后存在過敏或傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。自上世紀(jì)80年代Vacani開始利用組織工程技術(shù)修復(fù)治療骨缺損以來，人工生物復(fù)合材料作為修復(fù)材料填充骨缺損的方法被越來越多的學(xué)者重視。然而符合臨床治療要求的人工復(fù)合材料需要具有良好的可降解性和生物屬性[4-6]。具有良好的骨誘導(dǎo)性和傳導(dǎo)性，能有利于骨細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)，因此，目前人們?nèi)晕凑业酵耆吓R床要求的骨修復(fù)材料[7-8]。本實(shí)驗(yàn)將脫鈣骨基質(zhì)顆粒與絲素蛋白按照不同比例復(fù)合后在幼兔骨缺損模型體內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)幼兔橈骨大體觀察、影像學(xué)檢查、組織學(xué)檢查等。并將數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)價(jià)修復(fù)材料對(duì)幼兔橈骨缺損的骨愈合能力。

絲素蛋白(SF)是由天然的纖維蛋白構(gòu)成，具有優(yōu)良的降解性能和良好的生物相容性，其降解產(chǎn)物無(wú)毒性、低免疫原性和機(jī)械強(qiáng)度較高等特點(diǎn),使許多研究者將成骨種子細(xì)胞和絲素蛋白結(jié)合起來制備具有骨修復(fù)能力的絲素蛋白材料，材料中的絲素蛋白可為細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附和分化提供所需的空間及環(huán)境[9-12]。鈣骨基質(zhì)(DBM)主要應(yīng)用于骨不連、骨髓炎及良性骨腫瘤刮除后的大段骨缺損，其內(nèi)含有骨形成蛋白誘導(dǎo)骨修復(fù)能力較強(qiáng)[13]，但由于脫去鈣鹽其塑形能力、機(jī)械強(qiáng)度變差[14]。有研究表明將支架材料孔徑控制在200～500 μm、孔隙率控制在40%～60%范圍內(nèi)更加有利于細(xì)胞長(zhǎng)入[15]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)脫鈣骨基質(zhì)和絲素蛋白質(zhì)量比為40%時(shí)，修復(fù)材料與骨缺損部位粘連和修復(fù)最好，其機(jī)制可能是因?yàn)橘|(zhì)量比為40%時(shí)可能材料內(nèi)部孔徑和孔隙率符合上述最佳范圍，進(jìn)一步增加DBM比例并不能是SF和DBM更加有效的結(jié)合在一起形成合適大小的材料孔徑，從而增強(qiáng)其粘連和修復(fù)能力。本實(shí)驗(yàn)沒有設(shè)計(jì)針對(duì)孔徑率的測(cè)試，有待后期試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過將絲素蛋白和同種異體脫鈣骨基質(zhì)按不同比例制作復(fù)合修復(fù)材料。并對(duì)幼兔橈骨骨缺損模型進(jìn)行修復(fù)手術(shù)移植修復(fù)，通過大體觀察、影像學(xué)檢查、免疫組化等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)觀察證實(shí)：絲素蛋白和脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合材料具有良好的成骨能力，且脫鈣骨基質(zhì)質(zhì)量為40%時(shí)成骨能力和修復(fù)能力最佳，可作為大面積骨缺損治療的一種可行性移植材料。