袁紅朝，賀 珍，張麗萍，耿梅梅，陳 聞，許麗衛(wèi)，李春勇，彭 燦，王久榮

(中國科學院 亞熱帶農業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南 長沙 410125)

氮是植物生長不可缺少的營養(yǎng)元素，同時也是溫室氣體N2O排放和水體富營養(yǎng)化(N素)的來源[1-4]。我國部分地區(qū)已經出現(xiàn)土壤氮飽和現(xiàn)象并超過了農田生態(tài)系統(tǒng)的臨界負荷，而農田土壤硝酸鹽的淋失被認為是造成湖泊、河流以及地下水硝酸鹽污染的主要原因之一[5-6]。水體中硝酸鹽污染導致了嚴重的水生生態(tài)和人類健康問題，包括水體富營養(yǎng)化、藻類瘋長、魚蝦類缺氧死亡、含氮的溫室氣體排入環(huán)境、飲用水水質惡化等環(huán)境問題，已經被人們普遍關注。元素循環(huán)過程中同位素組成變化記錄了元素轉化過程與生物環(huán)境影響因子的綜合作用[7-8]，氮的同位素在特定的污染源中具有特定的組成，能夠相對準確地反映污染物的遷移轉化機制[9-14]。因此，測定硝酸鹽的氮穩(wěn)定同位素組成可有效識別其主要來源，可作為水體環(huán)境硝酸鹽氮污染源的判定依據(jù)。

質譜法是穩(wěn)定同位素分析中最通用、最精確的方法。水中硝酸鹽氮穩(wěn)定同位素比值測定一般包括以下兩個步驟：通過反硝化細菌法[15]或者化學方法[16-17]將水中微量硝酸鹽轉化為N2O氣體，然后用帶自動預濃縮裝置的同位素比值質譜儀測定N2O中的氮穩(wěn)定同位素比值。其中，細菌反硝化法存在一定的缺陷，實驗所需的反硝化細菌需要專門培養(yǎng)，培養(yǎng)條件較高，整個反硝化過程中N2O氣體的收集與儲存對實驗儀器和實驗技能要求較高，因此，國內應用此方法的很少；相對于反硝化細菌法，化學轉化法對實驗儀器和實驗技能要求較低，應用較為廣泛[17-19]，但仍存在多點標準曲線難于建立、轉化產生N2O氣體的質量不便于在操作過程中監(jiān)控，需完成所有前處理步驟，上機測試后才能確定等問題。近幾年，隨著光腔衰蕩光譜(CRDS)[11-12]、離軸積分腔輸出光譜(OA-ICOS)[13]和傅里葉變換紅外光譜(FTIR)[14]等檢測技術的迅速發(fā)展，同位素光譜儀在土壤學、生態(tài)學、大氣科學等領域開始更廣泛的應用。氧化亞氮同位素光譜分析儀是應用激光吸收光譜技術的氮同位素分析儀，其測定過程不受目標氣體中同分子量的CO2的影響，能同時測量δ15N、δ17O和δ18O，具有分析成本低，分析速度快等優(yōu)點。在土壤學或生態(tài)學研究中，應用該分析系統(tǒng)通過同步分析N2O穩(wěn)定同位素(δ15N和δ18O)及N2O濃度和異構體N2O的同位素組成，從而實現(xiàn)快速、直觀的反映生態(tài)系統(tǒng)中土壤N2O排放特征[20-22]。本文通過化學轉化法對不同來源的水中硝酸鹽進行前處理，產生的N2O氣體導入氧化亞氮同位素光譜分析儀測定氮穩(wěn)定同位素比值，檢驗了光譜法在線分析精密度。新建立的方法可為湖泊、河流以及地下水等水體中硝酸鹽氮穩(wěn)定同位素比值高效準確測量提供方法參考，對促進流域環(huán)境水體硝酸鹽污染源追蹤溯源、控制及修復治理方面意義重大。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

Picarro G5131-i(高精度氮氧同位素及氣體濃度分析儀)：美國Picarro公司。該儀器使用中紅外的光腔衰蕩光譜(CRDS)技術，具有時間測量的超高穩(wěn)定性和超過8 km光程等特性，可實現(xiàn)較高精度N2O氣體濃度和δ15N的檢測分析。儀器檢測濃度范圍為300～1 500 nmol/mol，N2O濃度精度<0.05 nmol/mol(1-σ，10 min均值)，δ15N精度<0.7‰(1-σ，300 s均值)。

氣體采集及進樣裝置(作為前端，匹配Picarro G5131-i使用[23])主要由多個PLC控制模塊、多個獨立電磁閥、多個二通采氣閥組等組成。通過自動控制軟件控制各種閥的啟動及切換，實現(xiàn)多樣品在線采集和獨立分析測試，全過程均為自動控制。

N2O發(fā)生前處理反應瓶容積500 mL(蜀牛)，氣密性瓶蓋配備密封氣墊(Labco，用于注射器等)和采樣通道(用于電磁閥控制進樣口)及平衡氣袋(Tedlar，用于平衡反應瓶內部氣壓)，具體構造見圖1。

1.2 主要材料與試劑

1.2.1標準品 硝酸鹽標準品：IAEA-硝酸鉀標準品(δ15NAirN2=4.7‰)，購于IAEA國際原子能機構；實驗室硝酸鉀標準品(δ15NAirN2=-2.8‰)，購于Sigma-Aldrich，純度≥99.9%，中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所穩(wěn)定同位素實驗室標定。

圖1 N2O發(fā)生前處理反應瓶構造Fig.1 Structure of the N2O production bottom

硝酸鉀參比溶液：將兩種標準樣品均配制成10 μmol/mL的參比溶液。

N2O標準氣：購于法國液空公司，貨號X03NI79C33AC005，濃度1 500 nmol/mol，δ15NAirN2=(2.2±0.3)‰。

N2O工作標準氣：委托國家計量科學研究院配制，濃度1 500 nmol/mol，中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所穩(wěn)定同位素實驗室標定，δ15NAirN2=(-2.3±0.4)‰。

1.2.2前處理試劑 氨基磺酸溶液[c(NH2SO2H)=0.2 mol/L]；醋酸-醋酸鈉緩沖液[c(CH3COOH-NaC2H2O2)=1 mol/L]，pH=4.7。鎘粒還原劑：鍍銅鎘粒，北京鵬利馳科技有限公司。以上試劑和藥品為優(yōu)級純，除特別說明外，均購置于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2.3待檢測水樣 JJ1～JJ3分別來自中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所長沙農業(yè)環(huán)境監(jiān)測研究站湘江支流水量及氮磷含量長期監(jiān)測定位點的地表徑流水[24]，樣品采集時間為2020年8月16日，水樣采集后密封保存于500 mL聚四氟乙烯瓶中并于4 ℃條件下運輸至實驗室。水樣中硝態(tài)氮含量用AA3流動注射儀測定(SEAL AA3,Norderstedt,德國)，具體采樣點信息見表1。

1.3 實驗方法

硝酸鹽還原前，預先用氨基磺酸破壞和除去土壤提取液中原有的亞硝酸鹽，而銨和其他形態(tài)氮均不影響硝酸鹽的還原反應。

表1 三種待測水樣的信息Table 1 Information of the three types of water samples

1.3.2標準參比溶液及水樣中硝態(tài)氮-N2O轉化 吸取一定量的參比溶液于冷凍干燥機中凍干(24 h)，干粉轉移至前處理反應瓶，再分別加入1.0 mL氨基磺酸溶液和50 mg鍍銅鎘粒于反應瓶，密封反應瓶，用真空泵抽真空后，用注射器加入3.0 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液后注入高純空氣(保證反應瓶中壓力為常壓)，將反應瓶放入恒溫搖床中(25 ℃)，以120 r·min-1振蕩16 h，反應生成N2O氣體。上述反應體系中氮含量分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、10 μmol，同時做試劑空白，每組重復6次。

取5～10 mL的待檢水樣于冷凍干燥機中凍干(24 h)，干粉轉移至前處理反應瓶中，加入1.0 mL的氨基磺酸溶液和50 mg鍍銅鎘粒還原劑后振蕩5 min去除水樣中含有的亞硝酸鹽，加蓋密封抽真空，加入3.0 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液，并注入高純空氣。將反應瓶置于恒溫搖床中(25 ℃)，以120 r·min-1振蕩16 h，反應生成N2O氣體。每個樣品做3次重復。

1.3.3N2O氣體濃度及氮穩(wěn)定同位素比值測定 將Picarro G5131-i分析儀的進樣口(流速20 mL/min)與氣體采集及進樣裝置(前端)連接，同時設置前端的樣品采集參數(shù)，包括采樣和旁路閥切換模式，其中樣品采集時間為5 min；旁路(空氣)3 min，依次順序進樣，測定完成后自動切換至旁路待機。

待儀器穩(wěn)定后，將反應瓶的采樣通道與儀器進樣前端連接，打開采樣通道的三通閥，反應瓶中的N2O通過前端化學阱除去大部分的水汽及雜質，進入Picarro G5131-i分析儀內，檢測N2O氣體中的氮氧穩(wěn)定同位素比值。檢測器測量間隔為10 s，選取進樣后3 min內測定值的平均值作為樣品的檢測結果，每5個樣品進行1次標準氣校準(N2O工作標準氣)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與繪圖

使用Excel 2013和SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行處理，使用OriginPro 8軟件進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 標準硝酸鉀參比溶液的測試

標準硝酸鉀參比溶液經過前處理轉化生成N2O氣體，再結合自動進樣前端-Picarro G5131-i分析儀聯(lián)用系統(tǒng)測定N2O氣體濃度及其氮穩(wěn)定同位素比值，測定的結果示于圖2～圖3。

圖2 不同氮含量下2種標準硝酸鉀參比溶液轉化產生N2O氣體濃度及其產率(柱條代表N2O氣體濃度，符號(圓圈和三角)代表產率，數(shù)據(jù)為平均值，誤差棒為SD值，n=6)Fig.2 Concentration and yields of N2O production of two types of KNO3 standard solution relative to the content of N (Bars represent the concentration of N2O, the symbols (circle, triangle) represent N2O yieldData are mean ± standard deviation (n=6))

本研究參考水體中硝酸鹽含量，采用0.2～10 μmol共7個濃度梯度的硝酸鉀標準品參比溶液進行了前處理，產生的N2O濃度在100～7 000 nmol/mol之間(見圖2)，其中1.0～2.5 μmol濃度范圍內的實驗樣品產生的N2O濃度在儀器的最佳檢測量程范圍(300～1 500 nmol/mol)，而10 μmol參比溶液樣品產生的N2O氣體濃度超出最高限近4倍。該套前處理反應體系的N2O產率為50%～75%，且隨著反應體系氮含量的增加，N2O的產率增加，與曹亞澄等[17]的研究結果基本一致。

圖3 光譜法測定標準硝酸鉀參比溶液氮同位素比值的準確度與精密度(數(shù)據(jù)為平均值，誤差棒為SD值，n=6)Fig.3 Precision and accuracy of the determination of 15N abundance of two types of KNO3 standard solution relative to the content of N determined by laser spectrum analysis system(Data are mean ± standard deviation, n=6)

標準硝酸鉀參比溶液的氮同位素比值測定結果(見圖3)顯示，在儀器最佳測量范圍內的樣品均獲得了理想的δ15N結果，分別為4.33‰～5.17‰和-2.38‰～-3.18‰，與給定值4.7‰和-2.8‰基本一致(差值小于0.5‰)，前處理(包括冷凍干燥)過程未對樣品造成同位素分餾，6次重復測定的標準偏差也小于0.5‰。而超出測定量程的參比樣品δ15N值測定的準確度和精密度均較差，重復誤差在1.0‰～2.5‰，與標定值偏離超過了2‰，因此，在保證理想的測試準確度和精密度條件下，推薦單次反應體系中氮最低量為0.5 μmol，而最佳范圍為1.0～2.5 μmol。

2.2 水樣中硝態(tài)氮的測試

用經典的穩(wěn)定同位素質譜法測定樣品值作為參考值。根據(jù)前處理最佳樣品量的要求，取8 mL水樣進行冷凍干燥濃縮。濃縮后的水樣按照方法要求進行前處理，通過自動進樣前端-Picarro G5131-i分析儀聯(lián)用系統(tǒng)測定其中的氮穩(wěn)定同位素比值，測定結果見表2。由表2可知，三個采樣點水樣品的氮同位素比值測試結果較好，數(shù)據(jù)的標準偏差(n=6)均小于0.5‰，與質譜法測定值的絕對偏差小于0.5‰。

表2 激光光譜儀測定3種未知水樣三個重復樣中硝態(tài)氮的δ15N值(n=6)Table 2 Results of nitrogen isotope of three types of water sample determined by laser spectrum analysis system (n=6)

3 結論

本研究通過一系列實驗方法驗證，建立了冷凍干燥預濃縮結合化學轉化N2O氣體的樣品前處理方法，并建立了自動進樣前端-激光光譜儀聯(lián)用系統(tǒng)，檢測水中硝態(tài)氮穩(wěn)定同位素的測定方法。采用該套分析方法對不同來源水樣中的硝態(tài)氮進行了氮穩(wěn)定同位素測試，研究結果表明，該方法的檢測限低，僅需要約10 mL的水樣，就可獲得理想的測試結果，滿足常規(guī)樣品的分析，可為初步判別水體中硝態(tài)氮的來源，為水環(huán)境污染的預防、控制與治理提供方向。相較傳統(tǒng)質譜法分析中涉及的多次樣品氣低溫冷阱預濃縮，測試時長需約30 min，而光譜法操作簡單快速，測試時長僅需5 min，不涉及復雜的定量結果校正。此外，穩(wěn)定同位素比率質譜儀的購置成本和維護成本遠高于激光光譜儀。因此，鑒于該方法測試精度高，所用儀器設備自動化程度高、操作簡單、維護和測試成本低廉等諸多優(yōu)點，在水體環(huán)境質量的監(jiān)測和水體硝酸鹽污染源追蹤溯源等研究中具有廣闊的應用前景。