王軍岐 駱 晴 申駿龍 付小偉

(寶雞市中心醫(yī)院胸外科，陜西省寶雞市 721008)

食管癌是我國高發(fā)癌癥之一，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為可能與生活方式、飲食習(xí)慣、人乳頭狀瘤病毒感染等有關(guān)[1]。食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)患者數(shù)量占食管癌患者數(shù)量的90%以上[1]。隨著內(nèi)鏡檢查技術(shù)的進(jìn)步，早期ESCC和淺表ESCC的檢出率越來越高。內(nèi)鏡下黏膜剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection，ESD)是治療早期和淺表ESCC的標(biāo)準(zhǔn)方法[2]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF-2)是一種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)新生血管形成，其在腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲過程中發(fā)揮重要作用[3]。血管生成抑制蛋白1(vasohibin 1，VASH1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種血管生成負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有抑制腫瘤血管生成的作用[4]。關(guān)于FGF-2、VASH1表達(dá)與淺表ESCC關(guān)系的研究已有報(bào)告，但關(guān)于兩者與淺表ESCC患者ESD后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移之間關(guān)系的研究少見?；诖?，本研究探討FGF-2、VASH1表達(dá)與淺表ESCC患者ESD后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，旨在為患者的預(yù)后評(píng)估提供新方法。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析 從TCGA數(shù)據(jù)分析和可視化網(wǎng)站GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)中下載淺表ESCC組織及正常食管組織中FGF-2、VASH1的mRNA表達(dá)情況，分析FGF-2、VASH1 mRNA在淺表ESCC組織及正常食管組織中的表達(dá)差異。

1.2 臨床研究

1.2.1 臨床資料：選擇2014年1月至2015年6月在本院行ESD治療的92例淺表ESCC患者的臨床資料及病理組織。其中男性53例、女性39例，年齡29～73(51.24±8.47)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)標(biāo)本經(jīng)病理診斷為原位癌(Tis)或T1期ESCC；(2)均為首次治療，術(shù)前未接受任何治療；(3)臨床資料和隨訪記錄完整，癌組織標(biāo)本均保存完好。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤病史；(2)合并高血壓、糖尿病或傳染性疾病患者。從上述92例患者中選取50例患者，收集其癌旁正常食管組織(距離癌組織邊緣≥5 cm)標(biāo)本作為對(duì)照。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 資料收集：通過查閱住院病歷和復(fù)診記錄收集患者的相關(guān)資料，包括年齡、性別、分化程度、有無管腔狹窄、浸潤(rùn)深度、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)：檢測(cè)淺表ESCC組織及正常食管組織中FGF-2、VASH1蛋白的表達(dá)情況。試劑包括免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-過氧化物酶(streptavidin-perosidase,SP)試劑盒(批號(hào)：20140802)、兔抗人試劑盒(一抗，批號(hào)：20150314)、羊抗兔試劑盒(二抗，批號(hào)：20141126)，均購自Abcam公司。從-80 ℃環(huán)境中取出凍存的組織標(biāo)本，用10%的福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，制作成4 mm切片后進(jìn)行脫蠟處理。脫蠟后用3%過氧化氫溶液孵育10 min，使用PBS洗滌3次(3 min/次)，使用檸檬酸鹽緩沖溶液高溫抗原修復(fù)后，再用PBS洗滌3次(3 min/次)，滴加一抗(稀釋比例1 ∶200)1滴，4 ℃孵育過夜，滴加二抗(稀釋比例1 ∶1 000)1滴，37 ℃孵育60 min，滴加二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。用PBS代替一抗重復(fù)上述試驗(yàn)作為陰性對(duì)照。在電子顯微鏡(濟(jì)南泰醫(yī)生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：CX23)下觀察染色情況，隨機(jī)選取5個(gè)有代表意義的視野(×100)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)，最終結(jié)果取5個(gè)視野的平均值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：按染色強(qiáng)度評(píng)分，其中無染色為0分，淺黃色為1分，黃色或黃棕色2分，棕褐色為3分；按陽性細(xì)胞百分比評(píng)分，其中陰性記0分，<25%記1分，25%～<50%記2分，50%～75%記3分，>75%記4分。取兩種評(píng)分的乘積作為評(píng)估結(jié)果，≤1分為表達(dá)陰性，>1分為表達(dá)陽性；≥3分為高表達(dá)，<3分為低表達(dá)。

1.2.4 隨訪：患者ESD后隨訪5年，觀察患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移判斷標(biāo)準(zhǔn)[5]為，患者門診復(fù)查時(shí)進(jìn)行CT或超聲等影像學(xué)檢查，檢查結(jié)果提示原食管瘤復(fù)發(fā)、吻合口復(fù)發(fā)，腹腔和縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，或骨、肺、胸膜等轉(zhuǎn)移。本研究中，術(shù)后復(fù)發(fā)患者均經(jīng)食管鏡檢查證實(shí)吻合口復(fù)發(fā)，并有病理依據(jù)；92例患者中，發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移54例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入與統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性；采用Logistic回歸模型進(jìn)行影響因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 淺表ESCC組織及正常食管組織中FGF-2和VASH1 mRNA的表達(dá)水平 從GEPIA數(shù)據(jù)庫中共下載到182例淺表ESCC組織和286例正常食管組織的數(shù)據(jù)，對(duì)兩種組織的FGF-2和VASH1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示淺表ESCC組織與正常食管組織的FGF-2和VASH1 mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。 淺表ESCC組織中FGF-2與VASH1 mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.460，P<0.001)，見圖1。

表1 淺表ESCC組織及正常食管組織中FGF-2和VASH1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中淺表ESCC組織FGF-2與VASH1 mRNA表達(dá)相關(guān)性的分析結(jié)果

2.2 淺表ESCC組織及正常食管組織中FGF-2、VASH1蛋白的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(見圖2-A、圖2-B)，VASH1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜(見圖2-C、圖2-D)。淺表ESCC組織中FGF-2蛋白、VASH1蛋白的陽性表達(dá)率均高于正常食管組織(均P<0.05)，見表2。淺表ESCC組織中FGF-2與VASH1蛋白陽性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.388，P<0.001)。

圖2 FGF-2、VASH1蛋白在正常食管組織及淺表ESCC組織中的表達(dá)(SP染色，×100)注：A、C為分別FGF-2蛋白、VASH1在正常食管組織中的表達(dá)情況；B、D分別為FGF-2蛋白、VASH1蛋白在淺表ESCC組織中的表達(dá)情況。

表2 淺表ESCC及正常食管組織中FGF-2、VASH1蛋白表達(dá)情況的比較[n(%)]

2.3 FGF-2和VASH1蛋白表達(dá)與淺表ESCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系 不同年齡段、性別、管腔狹窄情況、浸潤(rùn)深度的患者之間，F(xiàn)GF-2、VASH1蛋白的陽性表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。低+中低分化程度、存在脈管癌栓、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者FGF-2、VASH1蛋白的陽性表達(dá)率更高(均P<0.05)，見表3。

表3 FGF-2、VASH1蛋白表達(dá)與淺表ESCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系(n)

2.4 不同F(xiàn)GF-2、VASH1蛋白表達(dá)水平淺表ESCC患者ESD后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率的比較 FGF-2低表達(dá)組49例，F(xiàn)GF-2高表達(dá)組43例，F(xiàn)GF-2低表達(dá)組患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為40.82%(20/49)，低于FGF-2高表達(dá)組的74.42%(32/43)(χ2=10.523，P=0.001)；VASH1低表達(dá)組45例，VASH1高表達(dá)組47例，VASH1低表達(dá)組患者ESD后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為42.22%(19/45)，低于VASH1高表達(dá)組的70.21%(33/47)(χ2=7.329，P=0.007)。

2.5 淺表ESCC患者ESD后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素 以淺表ESCC患者ESD后是否發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移為因變量，以可能影響復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素即年齡、性別、分化程度、管腔狹窄、浸潤(rùn)深度、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FGF-2及VASH1蛋白的表達(dá)水平為自變量，納入Logistic回歸模型中進(jìn)行單因素分析(變量賦值情況見表4)。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-2蛋白的表達(dá)水平、VASH1蛋白的表達(dá)水平、脈管癌栓、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響淺表ESCC患者ESD后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素(均P<0.05)，見表5。進(jìn)一步以單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量作為自變量(賦值同單因素分析)，納入多因素Logistic回歸模型中進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-2高表達(dá)、VASH1高表達(dá)、發(fā)生脈管癌栓、分化程度低和中低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是淺表ESCC患者ESD后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，見表6。

表4 變量賦值情況

表5 影響淺表ESCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素的單因素分析

表6 影響淺表ESCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素的多因素分析

3 討 論

食管癌是一種常見的消化道腫瘤，全球每年約有30萬人死于食管癌[6]。各國食管癌的發(fā)病率和死亡率各異，我國是高發(fā)地區(qū)之一，每年死于食管癌的患者約15萬人[7]。食管癌的病因尚不明確，多認(rèn)為可能與遺傳、亞硝胺類攝入過量、真菌感染、微量元素缺乏、食管慢性炎癥等有關(guān)[8-9]。淺表ESCC是指來源于食管黏膜及黏膜下層的腫瘤，包括Tis、黏膜腫瘤(T1a)和黏膜下層腫瘤(T1b)[10]，因此本研究納入的病例均為Tis或T1期患者。研究表明，F(xiàn)GF-2是一種促血管生成因子，能夠通過激活多種信號(hào)通路發(fā)揮生物活性，其可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移，同時(shí)也能促進(jìn)腫瘤血管生成，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[11]。何巖等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2在腎癌組織及腎癌細(xì)胞中高表達(dá)，敲除FGF-2表達(dá)后，腎癌細(xì)胞ACHN和786-O的增殖被抑制，而腎癌細(xì)胞中的磷酸化蛋白激酶B蛋白和磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶蛋白表達(dá)下降，推測(cè)FGF-2可能通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路調(diào)控腎癌細(xì)胞增殖。另有研究顯示，F(xiàn)GF-2可通過調(diào)節(jié)金屬蛋白酶及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子參與腫瘤的發(fā)生[13]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等分泌的促血管生成因子和抑制血管生成因子相互作用、共同調(diào)節(jié)，促使血管生成參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[14]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，淺表ESCC組織中FGF-2蛋白的陽性表達(dá)率高于正常食管組織，低+中低分化程度、存在脈管癌栓、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者FGF-2蛋白的陽性表達(dá)率更高，且FGF-2低表達(dá)組ESCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率低于FGF-2高表達(dá)組(均P<0.05)。這提示FGF-2可能參與淺表ESCC的發(fā)生和發(fā)展，與ESCC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，高表達(dá)FGF-2可能提示預(yù)后不良。結(jié)合上述FGF-2的作用，分析原因可能為FGF-2參與了淺表ESCC的新生血管生成，對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲起促進(jìn)作用，但其具體的作用機(jī)制有待深入研究。

VASH1是一種內(nèi)源性血管生成抑制劑，主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞終止區(qū)[15]。本研究結(jié)果顯示，淺表ESCC組織中VASH1蛋白的陽性表達(dá)率高于正常食管組織(P<0.05)，與時(shí)軍利等[16]的研究結(jié)果相似。進(jìn)一步研究顯示，低+中低分化程度、存在脈管癌栓、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者VASH1蛋白的陽性表達(dá)率更高，且VASH1低表達(dá)組ESCC患者ESD后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率低于VASH1高表達(dá)組(P<0.05)，提示VASH1可能與ESCC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。最近的研究結(jié)果表明，腫瘤血管生成能力增強(qiáng)時(shí)可反饋性使VASH1生成增多，即血漿VASH1水平升高可反映腫瘤血管的生成能力，因此VASH1水平升高時(shí)提示存在缺氧微環(huán)境，而缺氧是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的觸發(fā)因素之一，可誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[17]。這可能是VASH1水平升高與淺表ESCC的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后有關(guān)的原因。此外，本研究結(jié)果還顯示淺表ESCC組織中FGF-2與VASH1的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)(P<0.05)，提示FGF-2、VASH1可能相互作用，從而共同參與ESCC的發(fā)生和發(fā)展。

本研究結(jié)果還表明，在校正其他臨床病理特征等混雜因素后，F(xiàn)GF-2高表達(dá)、VASH1高表達(dá)是淺表ESCC患者ESD后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，F(xiàn)GF-2高表達(dá)、VASH1高表達(dá)的ESCC患者ESD后發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)分別為FGF-2低表達(dá)、VASH1低表達(dá)患者的2.461倍、2.426倍，進(jìn)一步說明了這兩個(gè)指標(biāo)與ESCC患者的預(yù)后密切相關(guān)。因此，檢測(cè)FGF-2、VASH1的表達(dá)可能對(duì)評(píng)估ESCC患者ESD后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況具有重要作用，有助于早期加強(qiáng)干預(yù)，從而改善患者預(yù)后。

綜上所述，F(xiàn)GF-2、VASH1在淺表ESCC組織中均呈高表達(dá)，兩者均與淺表ESCC患者的病情程度有關(guān)，且是影響患者ESD后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。后續(xù)將進(jìn)行細(xì)胞或動(dòng)物研究，深入探討兩者的作用機(jī)制，以期為改善淺表ESCC患者預(yù)后提供理論指導(dǎo)。