吳朝昕， 劉雪薇， 李祖軍， 龍武華， 宮彥龍， 朱速松

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院 水稻研究所， 貴陽 550006 )

葉綠體是植物獲取能量的重要細胞器，具有獨立于核基因組的遺傳體系。因為其基因序列保守，基因結(jié)構(gòu)重排事件遠低于核基因組,結(jié)構(gòu)簡單,一般為母系遺傳，所以被用來揭示物種的進化與親緣關(guān)系(李緒英等，2011；Li et al., 2018; Zhang et al., 2018; Jeon & Kim, 2019;朱斌等，2021)。由于發(fā)達的測序科技使不少生物實現(xiàn)了葉綠體基因組(cpDNA)測序，因此NCBI中收錄的葉綠體基因逐漸增多，利用葉綠體基因研究親緣關(guān)系的報道也不斷增多。在水稻中，F(xiàn)an等(2020)利用cpDNA分析了33個稻屬物種的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示OryzasativavoucherHSAGSDYD1802與O.sativacultivar TN1、O.sativacultivar RP Bio-226和O.sativacultivar IR8的親緣關(guān)系最近。Fang等(2017)通過分析cpDNA探討了根莖野生稻與其他13個稻屬物種的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示與根莖野生稻關(guān)系較近的是藥用野生稻且屬于CC基因類型。在其他物種中，張慧等(2018)利用cpDNA分析了益母草及其他16個物種的親緣關(guān)系，研究結(jié)果很好地解決了野芝麻亞科的進化關(guān)系。鄭祎等(2020)用大花君子蘭葉綠體基因序列與10個百合科、5個蘭科、4個鳶尾科及5個石蒜科共24個物種的葉綠體基因組序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，研究結(jié)果支持大花君子蘭屬于石蒜科，并使用其中23個物種葉綠體基因組中ycf2進行親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，葉綠體基因組中ycf2可以代替葉綠體基因組全長進行親緣關(guān)系分析。

大粒香是貴州省水稻研究所選育，具有稻米粒大且香的特點，并且大粒香在鄉(xiāng)村振興過程中為社會帶來了較高的經(jīng)濟效益(蔣志謙，2008；羅仁發(fā)等，2012)。目前，對大粒香基因組學、品質(zhì)形成等理論研究的文獻報道不多。基于大粒香在貴州優(yōu)質(zhì)稻發(fā)展過程中的重要性，為進一步從基因組水平認識和改良大粒香，本研究以大粒香DNA為材料進行測序，構(gòu)建大粒香cpDNA圖譜，分析密碼子的使用和重復序列，并分析其親緣關(guān)系，擬解決大粒香葉綠體基因組以下問題：(1)大粒香cpDNA的基本特征大??；(2)大粒香cpDNA密碼子偏好情況；(3)大粒香cpDNA系統(tǒng)發(fā)育所屬分支。

1 材料與方法

1.1 材料

以大粒香為材料，2019年冬季種植于海南三亞師部農(nóng)場基地，2020年2月選取無病蟲害、長勢良好的水稻葉片，沖洗、擦干液氮速凍暫存，用干冰保存寄回貴州，置于-80 ℃保存，用于提取大粒香DNA。

1.2 方法

1.2.1 大粒香DNA 提取及測序 使用TIANGEN植物DNA試劑盒提取大粒香總DNA，測序公司檢測合格后，構(gòu)建文庫，進行測序。

1.2.2 cpDNA序列組裝與注釋 將原始數(shù)據(jù),除去有污染、低質(zhì)量的片段，使用SPAdes軟件拼接后組裝。使用CPGAVAS2進行基因注釋，利用OGDRAW繪制大粒香的cpDNA圖譜。

圖 1 大粒香葉綠體基因組圖譜Fig. 1 Gene map of Dalixiang chloroplast genome

1.2.3 密碼子使用分析 使用CodonW進行密碼子使用分析。

1.2.4 重復序列分析 使用Vmatch完成大粒香cpDNA的長重復序列的查找。大粒香cpDNA的SSR篩選則使用MISA軟件，該軟件的檢測參數(shù)：單核苷酸大于8時被檢測；二核苷酸和三核苷酸大于4時被檢測。

1.2.5 系統(tǒng)進化分析 為探究大粒香與其他稻屬物種的親緣關(guān)系，從NCBI中下載了12個稻屬物種和2種禾本科近源物種的cpDNA(綠竹和高粱)，使用RaxML軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 大粒香cpDNA序列特征

大粒香cpDNA全長為134 563 bp，分為3個區(qū)：大單拷貝區(qū)(large single copy，LSC)(80 864 bp)，GC含量為37.09%；小單拷貝區(qū)(small single copy，SSC)(12 347 bp)，GC含量為33.37%；反向重復序列區(qū)(inverted repeats，IRs)(20 676 bp)，GC含量為44.41%。在大粒香cpDNA中注釋129個基因(表1)，可分為三類，即蛋白編碼基因、tRNA基因和rRNA基因，其數(shù)量分別為85、36和8。其基因功能主要為與自身復制能力有關(guān)、與光合作用有關(guān)、與其他基因和與未知功能有關(guān)4種。在蛋白編碼基因中，rps基因的數(shù)量最多有16個，而cemA、infA、ccsA、rbcL、matK、accD、clpP等基因數(shù)量僅有1個。其中，有20個基因出現(xiàn)在IR重復區(qū)內(nèi)，分別為ndhB、ycf1、rps12、rps7、rps15、rps9、rpl2、rpl23 8個蛋白編碼基因，rrn23S、rrn4.5S、rrn16S、rrn5S4個核糖體RNA，trnN-GUU、trnH-GUG、trnA-UGC、trnL-CAA、trnT-CGU、trnV-GAC、trnR-ACG、trnM-CAU8個轉(zhuǎn)運RNA(表1)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，大粒香cpDNA中有內(nèi)含子的基因共17個，其中ycf3有2個，剩余16個基因只有1個。trnK-UUU的內(nèi)含子堿基數(shù)最多，而trnL-UAA的最少(表2)。

表 1 大粒香cpDNA注釋基因列表Table 1 List of genes found in Dalixiang cpDNA

表 2 大粒香cpDNA含有內(nèi)含子的基因Table 2 Genes with introns in cpDNA of Dalixiang

2.2 大粒香cpDNA密碼子使用分析

在大粒香cpDNA密碼子中，亮氨酸密碼子使用了1 944次，為最多；半胱氨酸的密碼子僅使用198次，為最少。在編碼大粒香cpDNA的密碼子中有30個密碼子偏好性>1，其中以A結(jié)尾的有12個，以U(T)結(jié)尾的有16個，這表明大粒香cpDNA密碼子偏好A/U(T)堿基，這種情況常出現(xiàn)在杜梨、益母草等多種高等植物中(張慧等，2018；李泳潭等，2020；鄭祎等，2020)(表3)。

表 3 大粒香cpDNA密碼子使用Table 3 Codon usage in cpDNA of Dalixiang

2.3 大粒香cpDNA長重復序列和SSR分析

在大粒香cpDNA中檢測到19個長重復序列，包含了8個正向重復，長度范圍為30～52 bp，以及11個回文重復，其長度范圍為30～127 bp。最長的127 bp的重復序列位于rps19-psbK的基因間隔區(qū)內(nèi)，而含有最多長重復序列的區(qū)間為racL-accD。區(qū)域位置分布顯示，絕大多數(shù)分布在基因間隔區(qū)內(nèi)(表4)。

表 4 大粒香cpDNA的重復序列Table 4 cpDNA repeat sequence of Dalixiang

在大粒香cpDNA的129個SSR位點中有95個單核苷酸重復,并且70.07%的SSR由A或T組成，表明SSR位點有使用A/T堿基的偏好。同時，研究表明SSR位點在大粒香cpDNA上分布不均，在LSC區(qū)、SSC區(qū)以及IRs區(qū)分別分布了95個、18個和16個SSR位點(表5)。

表 5 大粒香cpDNA中的簡單重復序列Table 5 SSR in the cpDNA of Dalixiang

續(xù)表5

2.4 大粒香cpDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

將大粒香與粳稻、秈稻、野生稻及2個外類物種等共15個cpDNA序列構(gòu)建發(fā)育樹。發(fā)育樹分析表明，15個物種可分為三類，即第一類為Bambusaoldhamii，第二類為Sorghumbicolor，第三類為13個稻屬物種組成。在第三類群中又可分為4個小類群，其中3種野生稻(O.australiensis300316、O.meridionalis、O.ruifipogon)各為一類，其余10種栽培稻為一類。在栽培稻類群中，粳稻與秈稻分別處于不同進化分支。并且，大粒香水稻與粳稻Tropical Japonica在同一分支，表明兩者的進化關(guān)系比其他水稻品種近(圖2)。

圖 2 15種植物的cpDNA序列的系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree constructed using cpDNA of 15 plants

3 討論與結(jié)論

本研究測得大粒香cpDNA全長為134 563 bp，GC含量為39%，LSC為80 864 bp，SSC為12 347 bp，IR為20 676 bp，并注釋到129個基因，與已報道的禾本科數(shù)據(jù)相符(李裕華等，2020)。前人通過比對不同禾本科植物cpDNA序列表明，雖然葉綠體基因保守程度較高，但一些基因在進化過程中仍然出現(xiàn)退化缺失現(xiàn)象(唐萍等，2011；付濤等，2016)。本研究將大粒香cpDNA與Wang等(2016)報道的熱帶粳稻葉綠體基因組進行比對結(jié)果顯示，雖然二者在細胞色素b/f復合體相關(guān)基因、光系統(tǒng)Ⅰ、Ⅱ相關(guān)基因、核糖體蛋白大和小亞基相關(guān)基因、tRNA和未知功能基因等基因差異較少，但在大粒香葉綠體基因中不存在lhbA基因。lhbA基因是和光合作用過程中光系統(tǒng)Ⅱ有關(guān)的基因，在熱帶粳稻中存在lhbA基因，并且在喜好溫暖的禾本科植物毛竹中同樣也存在lhbA基因(Yao et al., 2016)，這可能是熱帶粳稻為適應熱帶光溫生長環(huán)境中逐漸進化而得。

SSR位點可被用于輔助育種和遺傳連鎖作圖等方面的研究，而cpDNA具有序列保守、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易測序等優(yōu)點，有助于解決類群間的遺傳多樣性(Powell et al., 1995; Pugh et al., 2004;Song et al., 2019)。本研究結(jié)果表明，大粒香cpDNA的SSR位點對A/U(T)堿基有著明顯偏好，這與前人研究結(jié)論相一致(張慧等，2018；李泳潭等，2020；鄭祎等，2020；王一麾等，2021；吳朝昕等，2021)。此外，大粒香cpDNA的密碼子也偏好A/U(T)堿基，這種密碼子使用情況也存在于其他物種中(Shinozaki et al., 1986;Ohyama et al., 1988;鄭祎等，2020；朱斌等，2021；吳朝昕等，2021)。大粒香cpDNA編碼蛋白質(zhì)的密碼子和SSR位點都偏好A堿基或者U(T)堿基，可能是造成大粒香cpDNA總A/U(T)含量大于總GC含量的原因。根據(jù)Niu等(2007)的研究報道，因為A/T核苷酸含有7個氮原子，比G/C核苷酸少一個， 所以富含A/T核苷酸耗能更少，有利于cpDNA的復制。這可能是大粒香cpDNA富含A/U(T)的原因。

系統(tǒng)發(fā)育基因組學是利用分子數(shù)據(jù)來研究生物間發(fā)育關(guān)系的。由于cpDNA具有序列保守、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易測序等優(yōu)點，因此基于cpDNA進行的系統(tǒng)發(fā)育研究得到了很好的發(fā)展(Eisen,1998; Eisen & Hanawalt,1999; Delsuc et al., 2005)。本研究對優(yōu)質(zhì)稻大粒香cpDNA測序數(shù)據(jù)進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，研究結(jié)果表明大粒香與熱帶粳稻聚為一類；粳稻與秈稻不為一類，這一結(jié)果與林張翔等(2014)的研究結(jié)果相同，支持了Huang等(2012)的秈粳稻起源假說。

綜上所述，本研究所獲得的大粒香的cpDNA大小、結(jié)構(gòu)、基因數(shù)量、重復序列、密碼子偏好、系統(tǒng)發(fā)育樹等特征信息，為進一步研究大粒香的系統(tǒng)進化和育種研究提供了理論依據(jù)。