陳言博， 陳宗新， 夏快飛， 張明永， 王亞琴*

(1. 華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 廣州 510631； 2. 中國科學(xué)院華南植物園， 廣州 510650 )

鋅指蛋白是真核生物體內(nèi)一類被廣泛研究的轉(zhuǎn)錄因子家族，根據(jù)半胱氨酸(C)和組氨酸(H)殘基的數(shù)目和位置可將其分為C2H2、C2HC、C2C2、C2C2C2C2等類型(Laity et al., 2001)。C2H2型鋅指蛋白是鋅指蛋白中最常見的一類，在許多代謝途徑以及植物的生長發(fā)育和非生物脅迫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用(Ballerini et al., 2020; Yin et al., 2020; Rodas et al., 2021; Zhang et al., 2021)。目前，在水稻和擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)分別有189個(gè)和176個(gè)C2H2型鋅指蛋白，該類蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域具有CX2-4CX3FX5LX2HX3-5H(C為半胱氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸，H為組氨酸，L為亮氨酸，X為任意氨基酸)特征序列(Englbrecht et al., 2004; Agarwal et al., 2007)。根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)域的數(shù)目、序列和排列方式，擬南芥176個(gè)C2H2型鋅指蛋白可分為Set A、Set B和Set C，其中包含多個(gè)且離散的鋅指結(jié)構(gòu)域的一類歸為Set C(Pabo et al., 2001; Englbrecht et al., 2004; Ciftci-Yilmaz & Mittler, 2008)。根據(jù)鋅指特征序列中2個(gè)組氨酸之間的氨基酸數(shù)目，Set C可進(jìn)一步分為C1、C2和C3，C1家族可進(jìn)一步細(xì)分為C1-1i、C1-2i、C1-3i、C1-4i和C1-5i(Englbrecht et al., 2004)。有關(guān)C1家族的研究主要集中在C1-1i和C1-2i亞家族(Englbrecht et al., 2004; Ciftci-Yilmaz & Mittler, 2008)。

雙子葉植物擬南芥C2H2型鋅指蛋白的C1-2i亞家族包括ZAT5～7、ZAT10～12、ZAT18和AZF1～3等，該亞家族含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，鋅指特征序列中2個(gè)組氨酸之間的氨基酸數(shù)目為3個(gè)，大部分成員具有核定位信號及EAR motif(ethylene-responsive element binding factor-associated amphiphilic repression motif)，主要參與各種生物和非生物脅迫響應(yīng)(Lippuner et al., 1996; Meissner et al., 1997; Englbrecht et al., 2004; Sakamoto et al., 2004; Mittler et al., 2006; Liu et al., 2013; Shi et al., 2014; Yin et al., 2017)。在擬南芥中，AtAZF2對鹽和干旱脅迫處理均響應(yīng)強(qiáng)烈，而AtAZF1和AtAZF3的表達(dá)對非生物脅迫(鹽、干旱和冷)的響應(yīng)較弱，只有AtAZF2能夠被ABA(abscisic acid)誘導(dǎo)，這可能是由于AtAZF2啟動子中含有ABA響應(yīng)元件(Sakamoto et al., 2004)。過表達(dá)AtZAT18可以提高擬南芥的耐旱性，而突變AtZAT18則導(dǎo)致植物對干旱脅迫的耐受性降低(Yin et al., 2017)。組成型過表達(dá)AtZAT10的轉(zhuǎn)基因擬南芥生長受到抑制，并對干旱、鹽、高溫和滲透脅迫的耐受性增強(qiáng)，同時(shí)提高了ROS穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因，如AtAPX1和AtAPX2的轉(zhuǎn)錄(Sakamoto et al., 2004; Mittler et al., 2006)。有趣的是，AtZAT10基因敲除植株和RNAi干涉植株也表現(xiàn)出對鹽和滲透脅迫的耐受性增加，但調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚(Mittler et al., 2006)。除擬南芥外，其他雙子葉植物中也有關(guān)于C2H2轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)道。豌豆St(Stipulesreduced)基因通過影響細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)展調(diào)控豌豆托葉的大小(Moreau et al., 2018)。番茄基因H(hair)編碼C2H2型鋅指蛋白，過表達(dá)該基因后葉片毛狀體數(shù)量顯著增加(Chang et al., 2018)。苜蓿MtSUP(SUPERMAN)是C2H2鋅指蛋白，主要在分生組織、雄蕊、心皮邊緣等部位表達(dá)，在苜蓿中將該基因突變后影響花器官的數(shù)量和形態(tài)及果實(shí)發(fā)育(Rodas et al., 2021)。

禾本科植物結(jié)縷草中的ZjZFN1基因，編碼C2H2型鋅指蛋白，其表達(dá)受鹽脅迫、冷和ABA誘導(dǎo)，在擬南芥中異源過表達(dá)ZjZFN1發(fā)現(xiàn)，該基因通過影響活性氧的積累及鹽脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，提高擬南芥對鹽脅迫的抗性(Teng et al., 2018)。干旱脅迫誘導(dǎo)小麥TaZFP1B的表達(dá)，而過表達(dá)TaZFP1B的小麥對干旱脅迫的抗性顯著增加(Cheuk et al., 2020)。水稻中關(guān)于C2H2鋅指蛋白有一些文獻(xiàn)報(bào)道，如ZFP182、ZFP36、ZFP179、ZFP245和ZFP252等。過表達(dá)ZFP182能提高植物對鹽脅迫的耐受性(Zhang et al., 2012)。過表達(dá)ZFP36能夠提高抗氧化酶的活性，并增強(qiáng)水稻對干旱脅迫和氧化脅迫的耐受性；相反，ZFP36的RNAi干涉植株中抗氧化酶活性較低，對干旱脅迫和氧化脅迫更敏感(Zhang et al., 2014)。過表達(dá)ZFP179能夠提高水稻的耐鹽性，并且轉(zhuǎn)基因幼苗對外源ABA更加敏感(Sun et al., 2010)。過表達(dá)ZFP252的植株對鹽和干旱脅迫的耐受性增加，在鹽和干旱脅迫處理下，過表達(dá)ZFP252植株中OsDREB1A、OsP5CS和OsProT等非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量高于野生型和ZFP252沉默株系，說明OsDREB1A、OsP5CS和OsProT可能是ZFP252的下游基因(Xu et al., 2008)。

OsZAT12屬于C2H2鋅指蛋白的C1-2i亞家族，該類基因在許多代謝途徑以及植物的生長發(fā)育和非生物脅迫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用(Ballerini et al., 2020; Yin et al., 2020; Zhang et al., 2021; Rodas et al., 2021)，本實(shí)驗(yàn)室前期(陳宗新等，2019)克隆了OsZAT12基因，該基因在水稻根中特異表達(dá)，定位于細(xì)胞核，異源過表達(dá)OsZAT12擬南芥植株矮小，根生長受到抑制。水稻為重要的糧食作物，生物/非生物脅迫、植物激素等均影響植株發(fā)育和形態(tài)建成，進(jìn)而影響產(chǎn)量。然而，作為在植物生長發(fā)育和非生物脅迫中可能起著重要作用的OsZAT12，在水稻生長發(fā)育及非生物脅迫中的作用尚不清楚。因此，本文分析了OsZAT12的啟動子元件和轉(zhuǎn)錄活性，并采用qRT-PCR技術(shù)分析OsZAT12在非生物脅迫和植物激素處理下的響應(yīng)模式，以期為進(jìn)一步研究OsZAT12參與不同非生物脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制和參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

粳稻“中花11”(WT)，實(shí)驗(yàn)室自存。雙元載體pCAMBIA1301來自本實(shí)驗(yàn)室，CRISPR編輯相關(guān)載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-H、pYLgRNA-OsU6a/LacZ、pYLgRNA-OsU6a、pYLgRNA-OsU3/LacZ、pYLsgRNA-OsU3由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光實(shí)驗(yàn)室惠贈，大腸桿菌DH5a感受態(tài)菌種和根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 OsZAT12及其同源基因的保守結(jié)構(gòu)域分析

在NCBI和TAIR數(shù)據(jù)庫中查找擬南芥和水稻中的C1-2i亞家族成員，并導(dǎo)出這些基因的氨基酸序列。利用軟件ClusatlX 1.83進(jìn)行多重序列比對，使用軟件DNAMAN 6.0輸出圖片。本研究中，進(jìn)行多重序列比對的基因?yàn)锳tAZF1(At5g67450)、AtAZF2(At3g19580)、AtAZF3(At5g43170)、AtZAT5(At2g28200)、AtZAT6(At5g04340)、AtZAT7(At3g46090)、AtZAT10(At1g27730)、AtZAT11(At2g37430)、AtZAT12(At5g59820)、AtZAT18(At3g53600)、OsZFP252(AAO46041.1)、OsZFP245(AAQ95583)、OsZFP182(NP001051718.1)、OsZFP179(AAL76091.1)、OsZFP36(AAP51130.1)。

1.3 OsZAT12轉(zhuǎn)錄活性分析

雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)是螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase，LUC)檢測系統(tǒng)和海腎熒光素酶(renilla luciferase，REN)檢測系統(tǒng)的組合，常用來分析轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性。本研究使用擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，其中擬南芥原生質(zhì)體的提取參考Wu等(2009)的方法，雙熒光素酶活性的檢測根據(jù)Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒(Cat. No. E1910)中的說明書操作，并通過計(jì)算LUC/REN的比值分析OsZAT12的轉(zhuǎn)錄激活/抑制活性。

1.4 OsZAT12啟動子分析

以水稻OsZAT12基因的起始密碼子(ATG)上游2 000 bp 作為研究對象，利用在線啟動子分析工具PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，對OsZAT12的啟動子序列進(jìn)行調(diào)控元件的預(yù)測和分析。

1.5 OsZAT12基因在非生物脅迫和植物激素處理下的表達(dá)分析

1.5.1 水稻種子消毒及幼苗水培方法 水稻種子去殼后放入50 mL 離心管中，加75%乙醇表面消毒1 min，用2.5%次氯酸鈉消毒50 min，無菌水漂洗5次，將種子置于1/2 MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將以上培養(yǎng)5 d 的無菌苗移至96孔PCR塑料板(剪去管底)進(jìn)行水培(16 h 光照/8 h 黑暗，白天28 ℃/夜晚24 ℃)，水稻營養(yǎng)液配方參照“國際水稻研究所水稻營養(yǎng)液”配制，5～6 d 換一次水培液。

1.5.2 非生物脅迫處理方法 取苗齡14 d 的水稻幼苗為材料進(jìn)行非生物脅迫處理。具體如下：低溫脅迫，將水稻幼苗放置于4 ℃光照培養(yǎng)箱(16 h 光照/8 h 黑暗)中；滲透脅迫，將水稻幼苗置于含有20% PEG(polyethylene glycol)6 000的水稻營養(yǎng)液中；氧化脅迫，將水稻幼苗置于含有20 μmol·L-1甲基紫精(methyl viologen，MV)的水稻營養(yǎng)液中；鹽脅迫處理，將水稻幼苗置于含有100 mmol ·L-1NaCl的水稻營養(yǎng)液中。分別收取處理0、0.5、1、3、6、12、24、48 h 的整株幼苗，未處理材料同時(shí)取樣作為對照組，所有樣品于液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?。除低溫處理外，其他脅迫處理均在植物培養(yǎng)室(16 h 光照/8 h 黑暗，白天28 ℃/夜晚24 ℃)進(jìn)行。

1.5.3 植物激素處理方法 取苗齡14 d 的水稻幼苗作為材料，進(jìn)行植物激素處理。在培養(yǎng)液中分別添加100 μmol ·L-1脫落酸(abscisic acid，ABA)，1 μmol ·L-12, 4-表蕓苔素內(nèi)酯(2,4-epibrassinolide, 2,4-eBL)，1 μmol ·L-1吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，處理0、1、24、48 h 后取材(取整株幼苗)，未處理材料同時(shí)取樣作為對照組，所有樣品于液氮速凍后-80 ℃保存。激素處理的材料均放在植物培養(yǎng)室(16 h 光照/8 h 黑暗，白天28 ℃/夜晚24 ℃)。

1.5.4 水稻RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成 RNA提取根據(jù)華越洋超快型植物RNA提取試劑盒(Cat. No. 0416-50)的說明書進(jìn)行。參照Toyobo反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat. No. FSQ-301)說明書進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。

1.5.5OsZAT12基因的qRT-PCR(quantitative real-time PCR)檢測 本研究中的qRT-PCR采用SYBR染料法(GenStar 2 × RealStar Green Fast Mixture, Cat. No. A301-10)。以水稻eEF-1a基因?yàn)閮?nèi)參(qPCR-eEF-1a-F: 5′-GCACGCTCTTCTTGCTTTC-3′;qPCR-eEF-1a-R: 5′-AGGGAATCTTGTCAGGGTTG-3′)，采用2-△△CT法計(jì)算(Livak & Schmittgen, 2001)OsZAT12基因的相對表達(dá)量(qPCR-OsZAT12-F: 5′-GACCTGAACCATCCACCCTG-3′; qPCR-OsZAT12-R: 5′-CGGTATCCAAGAACTGGTGGAA-3′)。

1.6 OsZAT12基因過表達(dá)載體和CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

由于OsZAT12在水稻根中特異表達(dá)(陳宗新等，2019)，因此以野生型水稻根的cDNA為模板，利用引物OsZAT12-F: 5′-CGGGATCCATGAAGAGGTTTGCA-3′(酶切位點(diǎn)BamHI)，OsZAT12-R: 5′-AACTGCAGCTAGTAGCCGACGCA-3′(酶切位點(diǎn)PstI)擴(kuò)增OsZAT12基因，利用雙酶切法構(gòu)建到pCAMBIA1301載體上，得到過表達(dá)載體pCAMBIA1301::35S::OsZAT12。

利用華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的網(wǎng)站CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)設(shè)計(jì)OsZAT12敲除靶點(diǎn)。為提高敲除效率，采用雙靶點(diǎn)載體的策略，以O(shè)sZAT12基因設(shè)計(jì)2個(gè)靶點(diǎn)，其中靶點(diǎn)5′-CATGAGGCGCCACCGCGCCA-3′以U6為啟動子，靶點(diǎn)5′-TGCGACGACATGAGCATCAG-3′以U3為啟動子，具體載體構(gòu)建參考Ma等(2015)的方法。

1.7 OsZAT12基因遺傳轉(zhuǎn)化水稻及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

將1.6中構(gòu)建好的重組載體(過表達(dá)載體和CRISPR/Cas9載體)轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)進(jìn)水稻愈傷組織中，具體參考李美茹和李洪清(2003)、王亞琴等(2011)的方法。

轉(zhuǎn)基因植株的鑒定采用PCR方法。剪取T1代幼苗約2 cm 長的葉片，利用TPS溶液(100 mmol · L-1Tris-HCl, pH 8.0; 10 mmol · L-1EDTA-Na2, pH 8.0; 1 mol · L-1KCl)提取DNA。過表達(dá)OsZAT12的轉(zhuǎn)基因植株利用抗性篩選標(biāo)記基因HptII(hygromycin phosphotransferase II) 設(shè)計(jì)引物Hyg-F: 5′-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3′, Hyg-R: 5′-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3′，以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。CRISPR植株采用引物CRISPR-F: 5′-TCAGACAACAGAGAGGTTGGT-3′和CRISPR-R: 5′-TAGTAGCCGACGCAGTCAAC-3′擴(kuò)增OsZAT12包括靶位點(diǎn)在內(nèi)的片段，經(jīng)測序后檢測突變位點(diǎn)。

1.8 轉(zhuǎn)基因水稻幼苗對外源ABA的敏感性分析

取野生型、過表達(dá)OsZAT12和敲除OsZAT12植株的種子，經(jīng)表面消毒后播種于含不同濃度ABA(0、1、5、10 μmol ·L-1)的1/2 MS培養(yǎng)基上，每個(gè)株系在不同ABA濃度培養(yǎng)基上播種30粒種子，在植物培養(yǎng)室(16 h 光照/8 h 黑暗，白天28 ℃/夜晚24 ℃)培養(yǎng)10 d 后拍照并統(tǒng)計(jì)株高和根長。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)中每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用軟件SPSS Statistics中的單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析(*P<0.05；**P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子OsZAT12保守結(jié)構(gòu)域的分析

OsZAT12(Os05g0114400)基因編碼區(qū)全長597 bp，該基因不含內(nèi)含子，編碼198個(gè)氨基酸(陳宗新等，2019)。為進(jìn)一步研究OsZAT12蛋白結(jié)構(gòu)域的保守性及其序列特點(diǎn)，對擬南芥和水稻C1-2i亞家族中的部分成員進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果如圖1所示，OsZAT12的結(jié)構(gòu)域與擬南芥和水稻中的同源蛋白一致，均含有2個(gè)包含QALGGH保守序列的鋅指結(jié)構(gòu)域以及1個(gè)EAR motif(ethylene-responsive element binding factor-associated amphiphilic repression motif)。蛋白C末端的EAR motif通常被認(rèn)為具有抑制活性(Meissner & Michael, 1997; Englbrecht et al., 2004; Ciftci-Yilmaz & Mittler, 2008)。以上結(jié)果說明，OsZAT12是一個(gè)典型的C2H2型鋅指蛋白，屬于C1-2i亞家族，可能具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。

黑色部分表示相似性=100%，粉色部分表示相似性在75%～100%之間(不包括100%)，藍(lán)色部分表示相似性在50%～75%之間(不包括75%)，黃色部分表示相似性在33%～50%之間(不包括50%)，白色部分表示相似性低于33%。Black parts indicate similarities = 100%, pink parts indicate similarities between 75% and 100% (excluding 100%), blue parts indicate similarities between 50% and 75% (excluding 75%), yellow parts indicate similarities between 33% and 50% (excluding 50%), the white parts indicate similarities <33%.圖 1 水稻和擬南芥部分C2H2型鋅指蛋白氨基酸序列的多重比對Fig. 1 Multiple alignment of amino acid sequences of partial C2H2 zinc finger proteins in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana

2.2 轉(zhuǎn)錄因子OsZAT12的轉(zhuǎn)錄活性分析

采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測OsZAT12的轉(zhuǎn)錄活性，將OsZAT12與包含GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GAL4 DNA binding domain，GALBD)的效應(yīng)載體融合(圖2:A)，同時(shí)與攜帶熒光素酶基因的報(bào)告載體共同轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，檢測對照組和實(shí)驗(yàn)組的螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性并計(jì)算相對LUC/REN比值。實(shí)驗(yàn)組的相對LUC/REN比值顯著低于對照組(圖2:B)，說明轉(zhuǎn)錄因子OsZAT12具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。

A. 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)載體構(gòu)建示意圖，其中GALBE是GAL4結(jié)合元件，GALBD是GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，35S mini啟動子是只含46 bp 的35S啟動子； B. 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測OsZAT12的轉(zhuǎn)錄活性，報(bào)告載體和效應(yīng)空載體作為對照組，報(bào)告載體和連有OsZAT12的效應(yīng)載體作為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。對照組的LUC/REN比值設(shè)為1，**表示與對照組相比達(dá)到顯著水平(P<0.01)。A. Schematic structures of plasmids used in dual-luciferase assay, GALBE is GAL4 binding element, GALBD is GAL4 DNA binding domain, and 35S mini promoter indicates that 35S promoter only contains 46 bp; B. Dual luciferase reporter system detects the transcriptional activity of OsZAT12, the reporter and effector vectors serve as control group, the reporter vectors and the effector vector with OsZAT12 are used as the experimental group, values are ± s from three biological replicates. The LUC/REN ratio of control group is defined as 1, ** indicates significant difference compared with control group (P<0.01). 圖 2 OsZAT12的轉(zhuǎn)錄活性分析Fig. 2 Transcriptional activity analysis of OsZAT12

2.3 OsZAT12啟動子的序列分析

以水稻OsZAT12基因的起始密碼子(ATG)上游2 000 bp 為研究對象，使用啟動子在線分析網(wǎng)站對OsZAT12啟動子進(jìn)行調(diào)控元件預(yù)測，結(jié)果顯示，OsZAT12啟動子上調(diào)控元件非常豐富，除了基本的核心啟動子元件(TATA box和CAAT box元件)以外，該段序列中還具有非生物脅迫和激素相關(guān)的順式作用元件。其中，與非生物脅迫相關(guān)的有2個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件；與激素相關(guān)的元件包括3個(gè)GA響應(yīng)元件、3個(gè)ABA響應(yīng)元件、2個(gè)Auxin響應(yīng)元件和1個(gè)JA響應(yīng)元件等(圖3)。由此推測，OsZAT12基因的表達(dá)可能受非生物脅迫因子和多種激素的調(diào)節(jié)。

圖 3 OsZAT12啟動子的生物信息學(xué)分析Fig. 3 Bioinformatics analysis of OsZAT12 promoter

2.4 非生物脅迫處理下OsZAT12的表達(dá)分析

擬南芥ZAT12在活性氧以及非生物脅迫信號傳導(dǎo)中起著重要作用(Davletova et al., 2005)。水稻OsZAT12啟動子中含有非生物脅迫相關(guān)的元件(圖3)，推測其可能響應(yīng)非生物脅迫。因此，進(jìn)一步檢測了水稻幼苗在低溫(4 ℃)、滲透脅迫(20% PEG 6 000)、氧化脅迫(20 μmol·L-1MV)和鹽脅迫(100 mmol·L-1NaCl)處理下OsZAT12的表達(dá)。如圖4:A所示，低溫處理48 h 內(nèi)，OsZAT12的表達(dá)均呈下調(diào)趨勢，其中在處理12 h時(shí)，OsZAT12的表達(dá)量降到最低，之后略微上調(diào)。在滲透脅迫處理下，OsZAT12表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢，從3 h 上升一直到48 h，OsZAT12的表達(dá)量達(dá)到未處理時(shí)的2倍左右(圖4:B)。而在20 μmol·L-1MV和100 mmol·L-1NaCl的處理下，OsZAT12的表達(dá)量隨時(shí)間變化未出現(xiàn)明顯的上調(diào)或下調(diào)趨勢(圖4:C,D)。以上結(jié)果表明，OsZAT12基因的表達(dá)響應(yīng)多種非生物脅迫，并隨脅迫時(shí)間的延長其表達(dá)量出現(xiàn)不同的變化趨勢。

A. OsZAT12在4 ℃脅迫處理下的表達(dá)量分析; B. OsZAT12在20% PEG脅迫處理下的表達(dá)量分析; C. OsZAT12在20 μmol ·L-1 MV脅迫處理下的表達(dá)量分析; D. OsZAT12在100 mmol ·L-1 NaCl脅迫處理下的表達(dá)量分析。每組處理0 h 的相對表達(dá)量分別設(shè)為1，下同。*表示與對0 h比達(dá)到顯著水平(P<0.05)。A. Expression level of OsZAT12 under 4 ℃ treatment; B. Expression level of OsZAT12 under 20% PEG treatment; C. Expression level of OsZAT12 under 20 μmol ·L-1 MV treatment; D. Expression level of OsZAT12 under 100 mmol·L-1 NaCl treatment. The relative expression level of 0 h after each treatment is defined as 1, the same below. * indicates significant differences compared with 0 h (P<0.05). 圖 4 不同非生物脅迫下OsZAT12的表達(dá)水平Fig. 4 Expression levels of OsZAT12 under different abiotic stresses

2.5 不同植物激素處理下OsZAT12的表達(dá)分析

植物激素作為植物內(nèi)源信號分子，在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用。OsZAT12的啟動子中含有多個(gè)激素相關(guān)元件(圖3)，推測其可能響應(yīng)激素水平的變化。植物激素處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外施ABA顯著下調(diào)OsZAT12的表達(dá)。處理1 h 時(shí)OsZAT12的表達(dá)量迅速下降，在24 h 降到最低，約為對照的1/10，48 h 時(shí)略有升高(圖5:A)。相反，外施1 μmol·L-1的2,4-eBL，在1 h 時(shí)OsZAT12 表達(dá)開始上調(diào)，一直持續(xù)到48 h 且達(dá)到最高，為對照的12倍(圖5:B)。此外，IAA處理也能上調(diào)OsZAT12的表達(dá)，其表達(dá)量在24 h 達(dá)到最高，一直持續(xù)到48 h(圖5:C)。以上結(jié)果表明，OsZAT12對不同植物激素的響應(yīng)各異，可能參與不同植物激素信號對水稻生長發(fā)育的調(diào)控。

A. OsZAT12在100 μmol ·L-1 ABA處理下的表達(dá)量分析; B. OsZAT12在1 μmol ·L-1 24-eBL處理下的表達(dá)量分析; C. OsZAT12在1 μmol ·L-1 IAA處理下的表達(dá)量分析。*和**表示與0 h相比達(dá)到顯著水平(*P<0.05，**P<0.01)。A. Expression level of OsZAT12 under 100 μmol ·L-1 ABA treatment; B. Expression level of OsZAT12 under 1 μmol ·L-1 24-eBL treatment; C. Expression level of OsZAT12 under 1 μmol ·L-1 IAA treatment. * and ** indicate significant differences compared with the 0 h (*P<0.05，**P<0.01).圖 5 不同植物激素處理下OsZAT12的表達(dá)水平Fig. 5 Expression levels of OsZAT12 under different phytohormones treatments

2.6 OsZAT12轉(zhuǎn)基因植株的獲得

2.6.1OsZAT12敲除植株的篩選 使用特異檢測引物(CRISPR-F和CRISPR-R)先對OsZAT12敲除植株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對得到的單一PCR片段產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果得到了3個(gè)敲除OsZAT12的純合株系，其中oszat12-12-3和oszat12-8-15株系均為單堿基插入，而oszat12-10-10株系則是缺失一段序列(圖6)。

圖 6 不同OsZAT12敲除株系的測序結(jié)果Fig. 6 Sequencing results of different OsZAT12 knockout lines

2.6.2OsZAT12過表達(dá)植株的表達(dá)量檢測 獲得4個(gè)過表達(dá)OsZAT12純合株系，并分別命名為OE8、OE3、OE9和OE5。qRT-PCR結(jié)果(圖7)顯示，與野生型相比，過表達(dá)株系OE8、OE3和OE5的表達(dá)量顯著提高，OE9的表達(dá)量雖有所提高但與野生型無顯著差異。因此，本研究選取OE8和OE3用于后續(xù)研究。

WT中OsZAT12基因的相對表達(dá)量設(shè)為1。*表示與WT相比達(dá)到顯著水平(P<0.05)。Relative expression level of OsZAT12 in WT is defined as 1. * indicates significant differences compared with WT (P<0.05).圖 7 qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株中OsZAT12的表達(dá)量Fig. 7 qRT-PCR analysis of OsZAT12 expression in transgenic plants

2.7 OsZAT12轉(zhuǎn)基因水稻對ABA的敏感性分析

ABA作為脅迫激素，是植物響應(yīng)生物/非生物脅迫的重要調(diào)控因子(Chen et al., 2020; Bharath et al., 2021)。OsZAT12啟動子序列中包含3個(gè)ABA響應(yīng)元件(圖3)，并且ABA有抑制OsZAT12表達(dá)的作用(圖5:A)。在獲得過表達(dá)OsZAT12和敲除OsZAT12的植株后，進(jìn)一步檢測其對ABA的敏感性，結(jié)果表明，ABA抑制了野生型和OsZAT12超表達(dá)幼苗的生長，并隨著ABA濃度的升高抑制程度越大，而OsZAT12過表達(dá)株系的株高、根長都顯著高于野生型(圖8)。OsZAT12敲除植株的株高在5 μmol ·L-1ABA處理下顯著低于野生型；在低濃度ABA(1 μmol ·L-1)處理下，其根長顯著高于野生型；但在較高濃度ABA(10 μmol ·L-1)處理下，根長與野生型無顯著差異(圖8)。以上結(jié)果表明，過表達(dá)OsZAT12會降低水稻對ABA的敏感性，而敲除OsZAT12則在合適的ABA濃度下才會增強(qiáng)水稻對ABA的敏感性。

OsZAT12轉(zhuǎn)基因水稻在不同濃度外源ABA處理下的表型 (A)、株高 (B)和根長 (C)，標(biāo)尺=2 cm。OE8、OE3為OsZAT12過表達(dá)植株；oszat12-10-10為OsZAT12敲除植株。*和**表示與WT相比達(dá)到顯著水平(*P <0.05，**P<0.01)， n=30。下同。Phenotype (A), shoot length (B) and root length (C) of OsZAT12 transgenic rice under different concentrations of exogenous ABA treatment, scale bar=2 cm. OE8 and OE3 are OsZAT12 overexpression plants; oszat12-12-3, oszat12-10-10 and oszat12-8-15 are OsZAT12 knockout plants. * and ** indicate significant differences compared with WT (*P <0.05，**P<0.01), n=30. The same below.圖 8 OsZAT12轉(zhuǎn)基因水稻幼苗對ABA的敏感性分析Fig. 8 Sensitivity analysis of OsZAT12 transgenic rice seedlings to ABA

2.8 OsZAT12轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀的觀察與統(tǒng)計(jì)

農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，在分蘗期、抽穗期、成熟期這3個(gè)時(shí)期中，OsZAT12過表達(dá)水稻的株高均顯著低于野生型，而OsZAT12敲除植株則與野生型沒有顯著差異(圖9:A,B,D,F)； 根長和分蘗數(shù)這2個(gè)指標(biāo)，無論是OsZAT12過表達(dá)還是敲除植株，均與野生型無顯著差異(圖9:C,E,G)。OsZAT12敲除植株的每株穗數(shù)和結(jié)實(shí)率均顯著低于野生型， 而OsZAT12過表達(dá)株系與野生型則無顯著差異(圖9:H,I)。以上結(jié)果表明，OsZAT12影響水稻的株高、每株穗數(shù)和結(jié)實(shí)率。

A. OsZAT12轉(zhuǎn)基因水稻分蘗期、抽穗期和成熟期的表型，標(biāo)尺=5 cm; B-C. OsZAT12轉(zhuǎn)基因水稻分蘗期的株高和根長; D-E. OsZAT12轉(zhuǎn)基因水稻抽穗期的株高和分蘗數(shù); F-I. OsZAT12轉(zhuǎn)基因水稻成熟期的株高、分蘗數(shù)、每株穗數(shù)和結(jié)實(shí)率。OE8和OE3為OsZAT12過表達(dá)植株; oszat12-12-3、oszat12-10-10和oszat12-8-15為OsZAT12敲除植株。A. Phenotype of OsZAT12 transgenic rice at tillering stage, heading stage and maturity stage, scale bar = 5 cm; B-C. Plant height and root length of OsZAT12 transgenic rice at tillering stage; D-E. Plant height and and tiller number of OsZAT12 transgenic rice at heading stage; F-I. Plant height, tiller number, panicle number per plant and seed-setting rate of OsZAT12 transgenic rice at maturity stage. OE8 and OE3 are OsZAT12 overexpression plants; oszat12-12-3, oszat12-10-10 and oszat12-8-15 are OsZAT12 knockout plants. 圖 9 野生型和OsZAT12轉(zhuǎn)基因水稻的農(nóng)藝性狀Fig. 9 Agronomic traits of wide type and OsZAT12 transgenic rice

3 討論與結(jié)論

鋅指蛋白是真核生物體內(nèi)一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，其中C2H2型鋅指蛋白是最常見的一類(Takatsuji, 1999)。C2H2型鋅指蛋白通常包含1～6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，并在鋅指結(jié)構(gòu)的α-螺旋中含有QALGGH保守序列(Sakamoto et al., 2000; Englbrecht et al., 2004; Ciftci-Yilmaz & Mittler, 2008; Wang et al., 2019)。本研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsZAT12具有2個(gè)典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)和1個(gè)EAR motif，并與擬南芥ZAT12有較高的同源性，說明OsZAT12屬于水稻C2H2鋅指蛋白家族成員。大多數(shù)含有EAR motif的鋅指蛋白都表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄抑制活性(Ohta et al., 2001)，如矮牽牛ZPT2-3的瞬時(shí)表達(dá)分析表明其起著阻遏物的作用(Sugano et al., 2003)，而含有EAR motif like的擬南芥ZAT12，在響應(yīng)冷脅迫時(shí)可能作為AtCBF轉(zhuǎn)錄因子的抑制子起作用(Vogel et al., 2005)。本研究結(jié)果表明，水稻OsZAT12蛋白具有轉(zhuǎn)錄抑制活性，是一個(gè)有功能的轉(zhuǎn)錄抑制因子。

植物C2H2型鋅指蛋白作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，是目前研究較為深入的一類鋅指蛋白。該類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫中具有重要調(diào)控作用(Sakamoto et al., 2004; Davletova et al., 2005; Mittler et al., 2006; Rossel et al., 2007; Xie et al., 2012; Shi et al., 2014; Chen et al., 2016; Yin et al., 2017; Ballerini et al., 2020; Yin et al., 2020; Zhang et al., 2021; Rodas et al., 2021)。油菜BnLATE(LATE FLOWERING)通過限制油菜角果中木質(zhì)素的聚合減少角果的破裂(Tao et al., 2017)。水稻NSG1基因編碼C2H2型鋅指蛋白，與擬南芥SUP(SUPERMAN)、JAG(JAGGED)和NUB(NUBBIN)及水稻SL1(STAMENLESS1)的功能類似，參與調(diào)控水稻花發(fā)育(Dinneny et al., 2004; Ohno et al., 2004; Xiao et al., 2009; Zhuang et al., 2020)。組成型過表達(dá)AtZAT10的轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)為生長阻滯(Sakamoto et al., 2004; Mittler et al., 2006)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究(陳宗新等，2019)發(fā)現(xiàn)，異源過表達(dá)OsZAT12擬南芥植株矮小，根生長受到抑制。與異源轉(zhuǎn)化OsZAT12的擬南芥表型相似，該研究也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)OsZAT12水稻植株在分蘗期、抽穗期和成熟期的株高均顯著降低。該類表型都類似于擬南芥或水稻等植株遭遇脅迫后或過表達(dá)脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如DREB1植株的表型(Kasuga et al., 1999)，說明OsZAT12可能為脅迫相關(guān)基因。

植物對非生物脅迫的耐受性，主要依賴于激活植物體內(nèi)與脅迫相關(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括信號刺激的應(yīng)答、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、誘導(dǎo)信號通路基因的表達(dá)等(Dansana et al., 2014; Lima et al., 2015)。冷脅迫會對植物造成損傷，嚴(yán)重時(shí)可使植物死亡(Wang et al., 2017)。C2H2鋅指蛋白可通過直接調(diào)控下游冷脅迫相關(guān)基因來增強(qiáng)植物的抗寒能力(Han et al., 2020)。番茄SlCZFP1基因通過誘導(dǎo)COR(cold-regulated)或冷響應(yīng)相關(guān)基因的組成型表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻的耐寒性(Zhang et al., 2011)。大豆GmZF1通過結(jié)合COR6.6啟動子區(qū)并上調(diào)該基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因擬南芥對冷脅迫的抗性(Yu et al., 2014)。在香蕉中，過表達(dá)MaC2H2-2和MaC2H2-3顯著抑制MaICE1(inducer of CBF expression，冷信號傳導(dǎo)途徑的一個(gè)關(guān)鍵組成部分)的轉(zhuǎn)錄。因此，MaC2H2s可能通過抑制MaICE1的轉(zhuǎn)錄來增強(qiáng)香蕉的抗寒性(Han & Fu, 2019)。低溫處理上調(diào)擬南芥ZAT12的表達(dá)(Davletova et al., 2005)，過表達(dá)該基因則下調(diào)CBF(C-repeat/DREBindingFactor)基因的表達(dá)，表明ZAT12負(fù)調(diào)控?cái)M南芥對冷脅迫的適應(yīng)(Vogel et al., 2005)。本研究表明，4 ℃下調(diào)OsZAT12的表達(dá)，說明ZAT12在擬南芥和水稻中對低溫脅迫的響應(yīng)模式不同，暗示兩者的功能可能不同。許多非生物脅迫(如鹽、冷和干旱)，可誘發(fā)植物產(chǎn)生滲透脅迫(Han et al., 2020)。滲透脅迫導(dǎo)致植物生理干旱、離子失衡、氧化損傷和生長抑制(Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki, 2006)。擬南芥ZAT10在滲透脅迫處理后表達(dá)顯著上調(diào)，尤其是在葉片中；過表達(dá)ZAT10擬南芥和zat10突變體均表現(xiàn)出對滲透脅迫的耐受性增強(qiáng)(Mittler et al., 2006)。在擬南芥中，ZAT10被認(rèn)為是滲透脅迫的正調(diào)控因子并受MAP激酶的調(diào)控(Nguyen et al., 2016)。楊樹中鑒定出16個(gè)C1-2i亞家族成員，其中6個(gè)成員參與了滲透脅迫(Gourcilleau et al., 2011)。在擬南芥中異源過表達(dá)大豆GmZAT4，該基因可通過ABA途徑提高擬南芥對20% PEG 6 000的耐受性(Sun et al., 2019)。在水稻中，20% PEG 6 000處理后RZF71的表達(dá)顯著上調(diào)，表明該基因在滲透脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Guo et al., 2007)。與擬南芥ZAT10和水稻RZF71的表達(dá)模式不同，本研究發(fā)現(xiàn)，在20% PEG 6 000的滲透脅迫處理過程中，OsZAT12的表達(dá)先下降，隨后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯险{(diào)趨勢。綜合以上結(jié)果表明，OsZAT12的表達(dá)受到非生物脅迫(如低溫或滲透脅迫)的調(diào)控，因此推測OsZAT12參與了水稻響應(yīng)非生物脅迫的過程。

本研究對水稻OsZAT12啟動子分析發(fā)現(xiàn)其中含有激素相關(guān)元件，OsZAT12的表達(dá)在2，4-eBL、IAA處理后上調(diào)，推測OsZAT12參與了不同激素信號途徑。ABA是植物非生物脅迫中一個(gè)重要的調(diào)控因子，由于其廣泛在干旱、寒冷、高溫、 鹽脅迫和水澇等逆境中具有重要作用，因此被稱為脅迫激素(Chen et al., 2020; Bharath et al., 2021)。水稻C1-2i亞家族成員的ZFP179，ABA處理3 h 后其表達(dá)上調(diào)，隨后下調(diào)，至24 h 時(shí)達(dá)到最高(Sun et al., 2010)，而本研究卻發(fā)現(xiàn)，ABA顯著下調(diào)OsZAT12的表達(dá)，說明兩者在ABA信號傳導(dǎo)途徑中的功能可能存在不同。過表達(dá)ZFP179基因的水稻幼苗表現(xiàn)增加對ABA的敏感性(Sun et al., 2010)，而本研究則發(fā)現(xiàn)過表達(dá)OsZAT12降低了水稻對ABA處理的敏感性。過表達(dá)OsZAT12水稻幼苗和過表達(dá)ZFP179水稻幼苗對外源ABA敏感性的差異可能與這兩個(gè)基因?qū)BA的響應(yīng)模式不同有關(guān)。此外，OsZAT12敲除植株的株高只有在5 μmol ·L-1ABA處理下顯著低于野生型；在正常條件及低濃度ABA(1 μmol ·L-1)處理下，根長顯著高于野生型；在較高濃度ABA(10 μmol ·L-1)處理下，根長與野生型無顯著差異。我們推測，敲除OsZAT12后可能會降低植株內(nèi)源ABA含量，只有在外施合適濃度的ABA時(shí)，敲除OsZAT12植株才會表現(xiàn)出對ABA的敏感性增強(qiáng)，這與osbglu33水稻突變體及過表達(dá)ZmWRKY114的水稻植株對外源ABA的響應(yīng)方式相似(Ren et al., 2019; Bo et al., 2020)。結(jié)合OsZAT12對非生物脅迫(低溫脅迫和滲透脅迫)及脅迫激素ABA的響應(yīng)模式，推測OsZAT12參與調(diào)節(jié)非生物脅迫及激素信號途徑，進(jìn)而影響了水稻株型的發(fā)育，并在水稻穗型及結(jié)實(shí)中具有重要調(diào)控作用。本文進(jìn)一步深入研究了OsZAT12參與植物不同非生物脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制和ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，將為利用OsZAT12進(jìn)行水稻耐逆穩(wěn)產(chǎn)分子設(shè)計(jì)育種提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。