章來軍

杭州市園林綠化股份有限公司，浙江杭州

蘭花雖然是一種具有較高觀賞價值的園藝植物，但是普通的蘭花品種生長速度慢、養(yǎng)護難度高、繁育難度較大，導致蘭花無法大面積地應(yīng)用于園林綠化施工。雖然蘭花種苗可以自然分株繁殖，但是繁殖速度較慢，難以滿足市場應(yīng)用的需求[1]。當前主要是通過組織培養(yǎng)等技術(shù)大量培養(yǎng)種苗實現(xiàn)快速蘭花繁育。為提高種苗繁育效率，普遍采用技術(shù)加快種苗生長速度。然而這種繁育技術(shù)容易造成蘭花的抗性降低、相關(guān)性狀發(fā)生變化，影響后續(xù)繁育蘭花品質(zhì)[2]。

遠緣雜交技術(shù)利用親緣關(guān)系較遠的蘭花雜交，改善蘭花繁育過程中表現(xiàn)出的不良形狀。雜交物種優(yōu)勢能夠更加快捷地提高繁育速度與繁育后代植株的質(zhì)量。因此，本文將利用遠緣雜交原理對蘭花種苗進行繁育。

1 蘭花種苗繁育現(xiàn)狀

蘭花繁育主要是利用種子、分株培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、多倍體誘導四種方式。其中，利用種子繁育蘭花不僅受到蘭花生長速度緩慢的限制，而且因為蘭花種子發(fā)芽率低、部分蘭花品種不依靠種子進行繁殖，增加了繁育難度。分株培養(yǎng)能夠提高繁育速度，但是對于蘭花母株的傷害較大，無法大規(guī)模應(yīng)用。組織培養(yǎng)降低了對于蘭花母株的損傷，適用于大規(guī)模繁育[3]。但是組織培養(yǎng)會造成蘭花毒素累積，而脫毒處理增加了蘭花繁育成本。多倍體誘導的繁育方式會改變種苗的性狀，提升種苗質(zhì)量。但是多倍體誘導時，無法控制蘭花種苗性狀發(fā)生改變的方向，并且化學誘導對于試驗人員的危害較大。此外，多倍體誘導后的蘭花極容易出現(xiàn)后代性狀不穩(wěn)定等問題，繁育成本較高，應(yīng)用存在局限性。

2 遠緣雜交繁育材料與過程

2.1 繁育材料與準備

2.1.1 親本蘭種

從某地農(nóng)業(yè)科技園區(qū)C 中選擇蘭種作為遠緣雜交的雜交親本。其中，選擇野生蘭種作為繁育親代父本，分別編號為Y1、Y2；選擇具備目標繁育特性的蘭種A1、A2、A3、A4 作為繁育親代母本。植株親代的母本和父本蘭種在雜交過程中不可以互換。記錄所有親本的株高、形態(tài)、葉片信息、花冠信息、生長期特性等主要性狀，同時，確定親本性狀可以穩(wěn)定遺傳表現(xiàn)，以保證雜交育種可靠性。

2.1.2 繁育工具與試劑

雜交試劑：青霉素溶液、醫(yī)用級凡士林、無水氯化鈣等。

測試試劑：培養(yǎng)基成分（高純度蔗糖、硝酸銨、硝酸鉀、磷酸氫鉀、含水磷酸氫鈉、硼酸、硫酸鎂、硫酸鐵、6-BA、NAA、卡拉粉）

上述所有選用的雜交試劑和測試試劑均達到國產(chǎn)分析純標準。

雜交工具儀器：VD650/HD650超凈工作臺、ME204E電子天平、試管、干燥器、消毒脫脂棉、無菌標簽、篩子、研缽等。

2.2 遠緣雜交預(yù)處理過程

雜交處理前，以盆栽的形式將所有待雜交處理的蘭種分別放置在相同條件的玻璃溫室內(nèi)，以免進行親本間遠緣雜交操作時出現(xiàn)不可控因素。溫室環(huán)境的溫度、濕度、日照等條件均與蘭花自然生長設(shè)置一致。同時，溫室內(nèi)只保留所選擇的親本種類蘭種，避免影響雜交結(jié)果。

2.2.1 親本植株處理

在父本蘭種的開花期，從開花姿態(tài)旺盛的植株上采集花粉。摘取處于露色期父本的花蕾，并標注對應(yīng)的父本蘭種種類。使用無菌脫脂棉將花藥存放至加有無水氯化鈣的干燥器中。待24 h 后花藥完全干燥后，轉(zhuǎn)移并拍打花藥，由篩子將散出的花粉與花藥分離。每一次采集花粉操作后，需要完全清潔操作臺，避免花粉混合。收集后的花粉低溫密封保存，并注明對應(yīng)信息[4]。

從母本中選擇長勢良好的植株，去除發(fā)育明顯緩慢的花蕾。剩余花蕾處于露色期時，摘除花瓣和雄蕊，并巡視套袋確保雌蕊正常發(fā)育。

2.2.2 親本雜交狀態(tài)測定

在對親本開展雜交處理前，需測定父本花粉的生活力與母本雌蕊柱頭的可授性。將采集的花粉分別放置于培養(yǎng)皿中，使用蒸餾水浸泡花粉形成糊狀。取部分糊狀花粉于蓋玻片培養(yǎng)液中，分散花粉后制成顯微玻片。將玻片放置在培養(yǎng)皿中，25 ℃培養(yǎng)10天。使用顯微鏡觀察不同視野下的花粉萌發(fā)情況，按照下式計算花粉的有效萌發(fā)率[5]。

其中，mi為第i次觀測時，視野j中的萌發(fā)花粉數(shù)量；Mij為第i次觀測時，視野j中的花粉總量。

將1%聯(lián)苯胺、3%過氧化氫、蒸餾水按照4∶11∶22的配比配制柱頭可授性檢測溶液。在培養(yǎng)基中，使用聯(lián)苯胺反應(yīng)液浸泡不同開花期的新鮮雌蕊柱頭樣本。反應(yīng)10 min。在體視顯微鏡下觀察氣泡產(chǎn)生情況以及柱頭變色情況。表1 為不同花期采集的親本花粉和柱頭的檢測結(jié)果。

表1 蘭種親本花粉生活力與柱頭可授性檢測結(jié)果

由表1 可知，父本花期的第2~4 天花粉生活力最佳，而母本花期的第3天可授性增強，花期的第5天仍具有較好的可授性。

2.3 蘭花雜交繁育技術(shù)

在親代蘭種的花期選擇符合雜交要求的植株，對母本去雄處理后，將收集的母本花藥進行相應(yīng)的花粉采集處理。在每日的10 點前，將收集到的父本花粉由鑷子移放至已經(jīng)分泌粘液的母本柱頭腔內(nèi)。授粉過程中，去除母本蘭種的唇瓣，避免干擾其他柱頭授粉。為避免單次授粉失敗，對每一母本植株共授粉3次。根據(jù)正向授粉的操作信息，對已授粉的母本植株進行信息標注。在授粉后的1~3 天內(nèi)，觀察授粉對應(yīng)的花冠是否出現(xiàn)萎蔫、柱頭粘液是否干硬。在完全授粉的3~12 天內(nèi)，觀察母本子房是否膨大，并進行套袋管理母本蘭種，直至蘭種結(jié)實成熟。按照下式計算母本植株的稔實率R和結(jié)實率J。

上式中，TP表示完全授粉后，母本植株雌蕊出現(xiàn)子房膨大的數(shù)量；TS表示正向雜交授粉的總花朵數(shù)量；TC表示母本果實的成熟數(shù)量。

按照上述過程，將從母本花藥上采集的花粉授粉給父本雌蕊，完成反向雜交處理。記錄反向雜交處理的稔實率和結(jié)實率。

2.4 子代種苗培養(yǎng)與管理

收集正向和反向雜交得到的蘭花果實，對蒴果清洗、晾干后，處理蒴果得到雜交一代的蘭花種子。將蘭花種子按照標注信息，均勻地播撒在誘導培養(yǎng)基中。室溫28 ℃、光照強度1 500 Lx 培養(yǎng)一段時間。待種皮破裂，種胚發(fā)育逐漸形成原球莖后，進行繼代培養(yǎng)。

使用干凈無菌的小刀分割原球莖，將2 cm3大小的原球莖塊接種至繼代培養(yǎng)基中，誘導原球莖塊直至萌發(fā)成小苗。培養(yǎng)瓶中的小苗發(fā)育至具有5片真葉、萌發(fā)4~5條完整根系的主根、生長高度高于8 cm 時，移栽種苗至遮陰棚內(nèi)煉苗2周。從培養(yǎng)瓶中取出苗體，蒸餾水清洗種苗根系殘存的培養(yǎng)基。將種苗根系浸泡在800 倍多菌靈溶液15 min 后，通風晾干殘存水分。在育苗穴盤中逐層放置蛭石、育苗土后，移栽種苗?？刂品N苗假鱗莖低于育苗盤0.5 cm左右。定期向移栽后的種苗葉片噴水，避免植株干燥。根據(jù)蘭種的生長習性，待種苗根莖變粗、增高后，將蘭種移栽至透氣性良好的營養(yǎng)土中。按照常規(guī)蘭花育苗過程對雜交一代種苗進行養(yǎng)護，觀察F1 代種苗生長過程的性狀，測量相關(guān)數(shù)據(jù)，對比親本性狀表現(xiàn)評估蘭花遠緣雜交效果。

3 繁育技術(shù)測試

文中提出了一種蘭花遠緣雜交的繁育技術(shù)，在繁育過程中選擇相同數(shù)量的植株進行常規(guī)雜交繁育處理。通過對比不同繁育技術(shù)繁殖后，蘭花的繁育效率和繁育效果，評估所提出的繁育技術(shù)是否具有實際應(yīng)用價值。

表2為不同蘭花母本和父本在兩種技術(shù)繁育下，蘭花F1代性狀的變異系數(shù)和雜交子代的出苗率統(tǒng)計結(jié)果。

分析表2 中的數(shù)據(jù)可知，使用本文技術(shù)繁育得到的F1 代變異系數(shù)波動區(qū)間為14%~47%，高于常規(guī)繁育技術(shù)F1 代變異系數(shù)波動區(qū)間4%~12%。從變異系數(shù)來看，本文繁育技術(shù)對于F1 代的植株性狀的改變程度較大，而常規(guī)技術(shù)相對較差。從出苗率來看，本文技術(shù)繁育后的蘭花雜交種子的出苗率整體高于35%。而常規(guī)繁育技術(shù)的雜交種子出苗率存在明顯差異，出苗穩(wěn)定性較差。

表2 本文技術(shù)繁育F1代的變異系數(shù)和出苗率

圖1~3 分別為使用不同繁育技術(shù)培育的蘭花F1 代的花量、花期、植株高度性狀與親本平均值的對比曲線。

圖1 F1代蘭花種苗花量對比

圖2 F1代蘭花種苗花期對比

圖3 F1代蘭花種苗植株高度對比

對比分析圖1~3 可知，使用本文提出的繁育技術(shù)培育的F1 代蘭花大部分花量、花期、植株高度都較親代有不同程度的提升。而使用常規(guī)技術(shù)培育的種苗性狀表現(xiàn)較差，只有少部分種苗性狀表現(xiàn)較親本提升。由觀賞價值分析，本文技術(shù)培育出的雜交蘭花后代具有較高的觀賞價值。結(jié)合F1 代的變異系數(shù)可知，本文技術(shù)繁育出不同性狀的蘭花數(shù)量較多，有效提升了種苗的繁育效率。

4 結(jié)語

由于蘭花品種之間的差異，蘭花種苗的繁育速度與繁育質(zhì)量存在明顯差異。分析蘭花繁育技術(shù)現(xiàn)狀后，本文研究了一種蘭花種苗遠緣雜交高效繁育技術(shù)。通過對該技術(shù)的研究，探索蘭花雜交規(guī)律，提高蘭花種苗的雜交效率，選育具有良好性狀表現(xiàn)的蘭種，為我國苦苣苔蘭花雜交育種工作提供參考。