張瑩雪 孫鳳霞 李曉玲

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 (北京， 100029) 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院感染科

肝硬化是各種慢性肝病進展至以肝臟彌漫性纖維化、假小葉形成、肝內(nèi)外血管增殖為特征的病理階段[1]，其可以由任何原因的慢性肝損傷引起，最常見的原因是病毒性肝炎、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎。肝硬化的潛在機制尚不清楚，其發(fā)生和發(fā)展可能涉及多種類型的細胞、細胞因子和miRNA[2,3]。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有100萬人死于肝硬化并發(fā)癥，肝硬化目前是全球第11個最常見的死亡原因，帶來嚴重衛(wèi)生經(jīng)濟負擔(dān)[4]。肝硬化的治療目前主要是病因治療，抗炎抗肝纖維化，積極防治并發(fā)癥[5]。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)活血化瘀法有助于提高肝硬化治療的臨床有效性、改善患者臨床癥狀、促進肝功能恢復(fù)[6,7]。下瘀血湯為《金匱要略》用于治療婦人產(chǎn)后腹痛之方[8]，由大黃、桃仁、蟲三味藥物組成，方中大黃蕩逐瘀血，桃仁活血化瘀，蟲逐瘀破結(jié)，作為活血化瘀的基礎(chǔ)方，臨床加減用于治療婦科產(chǎn)后惡露不盡、閉經(jīng)、盆腔炎等多種瘀血相關(guān)病證。后代醫(yī)家亦將此方用于肝炎及肝硬化患者有瘀血癥狀者，療效顯著[9,10]。越來越多的研究提示，下瘀血湯具有抗肝纖維化、防治肝硬化的作用[11]。然而，其作用機制尚不明確。本文擬運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的方法，嘗試從中藥復(fù)方多靶點、多通路作用的角度，探討下瘀血湯對肝硬化潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 下瘀血湯有效成分及靶點的獲取 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，分別檢索大黃、桃仁,設(shè)置生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18。利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)，檢索蟲，設(shè)置“score cutoff”≥20，校正后P值<0.05，獲取具有統(tǒng)計學(xué)意義的有效活性成分和基因。然后應(yīng)用“PERL”軟件對所獲得的藥物成分及作用靶點進行合并。應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)校正靶點蛋白為規(guī)范的基因名稱，整理得到下瘀血湯的有效成分及對應(yīng)靶點數(shù)據(jù)信息。

1.2 肝硬化的相關(guān)基因的獲取 以“cirrhosis”為關(guān)鍵詞，分別從GeneCard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)對肝硬化相關(guān)基因進行搜索。應(yīng)用R軟件4.0.2中的“Venn”安裝包以及腳本將結(jié)果取并集，繪制韋恩圖。

1.3 獲取潛在靶點 利用R軟件將藥物活性成分相關(guān)的靶點和疾病靶點進行匹配映射，并繪制韋恩圖，獲得下瘀血湯活性成分的潛在治療肝硬化作用靶點。

1.4 構(gòu)建“藥物活性成分-疾病靶點” 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖 首先將1.1與1.2中最終獲得的數(shù)據(jù)通過“PERL”軟件以及腳本進行整理，然后應(yīng)用 Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“藥物成分-疾病靶點”的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。圖中節(jié)點(node) 代表藥物的活性成分或疾病與藥物活性成分的關(guān)鍵靶點基因，靶基因節(jié)點大小代表與其相連中藥化學(xué)成分的數(shù)目多少。在成分節(jié)點中，不同顏色代表成分來源于不同藥物。用邊(edge)來表示藥物成分與疾病靶點之間的相互關(guān)系，節(jié)點的度(degree)是指網(wǎng)絡(luò)中直接與該節(jié)點相連的邊的數(shù)目，如果degree越大，則提示其參與生物功能越多。

1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選 將1.3中藥物靶點與疾病相關(guān)基因交集文件導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，設(shè)置物種條件為人，置信度>0.4，同時隱藏斷開節(jié)點，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)。將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，應(yīng)用插件CytoNCA對節(jié)點進行打分并過濾，打分基于點度中心度、中間中心度、接近中心度、特征向量中心性、網(wǎng)絡(luò)中心性和局部邊連通性等指標。篩選每個打分大于中位數(shù)的基因作為核心基因，并進行兩次篩選，最終獲得網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析 利用R軟件對藥物成分-疾病靶點文件進行ID轉(zhuǎn)換，然后進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。其中GO分為生物過程(BP)、細胞組成(CC)、和分子功能(MF)三個模塊[12]。將P值過濾條件及校正后的過濾條件均設(shè)為0.05，GO富集結(jié)果中富集最高的前10項和KEGG通路富集結(jié)果中富集最高的前30項以可視化圖形表示出來。

1.7 GEO數(shù)據(jù)集靶點驗證 下載GEO數(shù)據(jù)庫芯片數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)集的編號為GSE77627，該數(shù)據(jù)集36例樣本，其中22例為肝硬化患者樣本，14例為對照組的樣本。下載編號為GSE77627數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)文件，包括其平臺文件以及序列探針矩陣文件。利用平臺注釋文件對探針進行注釋，將探針矩陣轉(zhuǎn)化為基因矩陣。利用“PERL”軟件將樣本整理為兩組，疾病組和健康組，對肝硬化患者組和健康對照組樣本的表達，利用limma包計算基因表達差異的P值和表達Fold Change值，進而選取校正后P<0.05 且|log2FC|>1(2倍關(guān)系)作為篩選顯著差異表達基因的閾值。利用“pheatmap”包將上調(diào)、下調(diào)最顯著的差異基因各20個，進行繪制差異基因熱圖及火山圖。

2 結(jié)果

2.1 下瘀血湯有效成分篩選與靶點預(yù)測 將篩選條件設(shè)置為OB≥30%，DL≥0.18，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫進行搜索共獲得40個有效成分，其中大黃16個，桃仁23個，蟲1個；同時共獲得1 028個預(yù)測靶點(見表1)。將有效成分及靶點預(yù)測文件采用“PERL”軟件及其腳本進行合并，然后應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫及“PERL”軟件進行標準化注釋、刪除無效及重復(fù)靶點，最終獲得94個作用靶點。

表1 “中藥-有效成分-疾病靶點”信息

2.2 肝硬化相關(guān)基因 通過GeneCard數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、PharmGkb數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫分別獲得肝硬化相關(guān)靶基因3 158、9、1、23和86個，經(jīng)整理后共獲得3 220個肝硬化相關(guān)靶基因。

2.3 藥物靶點與疾病靶點基因交集 經(jīng)過整理、分析共獲得藥物潛在活性成分靶點94個，疾病靶點3 220個，兩者得出的交集基因為55個。

2.4 “活性成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)分析 在“活性成分-核心靶點”圖中共有78個節(jié)點，其中來源于化合物的有23個，來源于基因的有55個(見圖1)。經(jīng)統(tǒng)計degree排前5的有效成分依次包括膽固醇(Cholesterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、澤蘭黃醇素(eupatin)、常春藤皂甙元(hederagenin)，其來源分別為蟲，桃仁、大黃，大黃，大黃，桃仁。

圖1 “活性成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(圓形節(jié)點代表藥物有效成分，不同顏色代表來自不同藥物(蟲-藍色，大黃-紅色，桃仁-紫色)，黑色線條代表邊，藍色方形節(jié)點代表中藥與疾病共同的靶基因)

2.5 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及核心基因預(yù)測 將藥物靶點與疾病靶點交集基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫中，以獲得它們之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點代表基因，不同的顏色代表不同的證據(jù)。同時將鄰接節(jié)點數(shù)目排前30位的基因進行可視化表示，見圖2，3。

圖2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖3 鄰接節(jié)點數(shù)目排前30位的基因

將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)篩選關(guān)鍵基因。第1次篩選條件分別為BC≥21.12，CC≥0.49，DC≥10，EC≥0.10，LAC≥4.57，NC≥5.33。第1次篩選結(jié)果共顯示14個節(jié)點，74條邊，得到14個核心基因。第2次篩選條件分別為BC≥1.98，CC≥0.84，DC≥10.5，EC≥0.27，LAC≥8.4，NC≥9.7。第2次篩選結(jié)果顯示5個節(jié)點，10條邊，得到5個核心基因，分別是PTGS2、CASP3、MYC、TP53、JUN。見圖4。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析核心基因

2.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析 經(jīng)過GO富集分析(圖5)共得到1 713條富集結(jié)果，其中生物過程(BP)1 561個，主要涉及對類固醇代謝及合成、維生素生物代謝及合成、DNA模板轉(zhuǎn)錄起始、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始等進行調(diào)節(jié)；細胞組分(CC)32個，主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等細胞組分等；分子功能(MF)120個，主要涉及配體激活、轉(zhuǎn)錄因子活性、核受體活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、類固醇結(jié)合等。經(jīng)過KEGG通路富集分析(圖6)共得到113條通路富集結(jié)果，涉及p53信號通路、乙型肝炎、丙型肝炎、細胞凋亡、神經(jīng)變性的途徑-多種疾病、IL-17信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等。提示下瘀血湯可能通過以上通路發(fā)揮對肝硬化的治療作用。

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

2.7 作用靶點的驗證結(jié)果 根據(jù)方法學(xué)部分所述，下載GSE77627數(shù)據(jù)集，經(jīng)過篩選一共獲得差異基因8 184個，例如MIR128-1、SNORD117、SNORD110、SNORD35B、NORD61等，其中上調(diào)基因4 057個，下調(diào)基因4 127個，GEO數(shù)據(jù)庫差異熱圖見圖7，其中紅色為高表達，黑色為中間表達，綠色為低表達。差異基因的火山圖見圖8，黑色點代表在試驗組和正常組沒有差異的基因，綠色點代表在正常組上調(diào)的基因，紅色點代表在試驗組上調(diào)的基因。將所獲得的差異表達基因與下瘀血湯對肝硬化的潛在作用靶點互相映射，交叉驗證取交集獲得18個共有靶基因，分別是：ADH1C、CASP3、DRD1、AR、KDR、CA2、MED1、NR3C2、JUN、ESR1、PRKCA、ESR2、NOS2、NR1H4、GFI1、VDR、CYP27A1、SLC6A3，可能為下瘀血湯治療肝硬化的潛在關(guān)鍵靶基因。

圖7 GEO數(shù)據(jù)庫差異熱圖

圖8 差異基因的火山圖

3 討論

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息分析學(xué)為基礎(chǔ)，對下瘀血湯進行了分析，為其多成分、多靶點、多途徑的作用機制研究提供了參考。

本研究發(fā)現(xiàn)下瘀血湯中關(guān)鍵化合物主要為Cholesterol、beta-sitosterol、aloe-emodin、eupatin、hederagenin等活性成分，發(fā)揮治療作用的5個關(guān)鍵靶點為PTGS2、CASP3、MYC、TP53、JUN。PTGS2參與了肝纖維化的主要發(fā)病機制，例如炎癥、凋亡和細胞衰老。此外，在患有非酒精性脂肪肝或肝硬化的患者和動物模型中，PTGS2呈異常表達。這些發(fā)現(xiàn)表明，PTGS2在肝纖維化的發(fā)展中具有廣泛而關(guān)鍵的作用[13]。Caspase分子在炎癥以及凋亡過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)隨著炎癥程度的增加，TRAIL表達顯著降低，而隨著晚期肝纖維化、肝硬化的發(fā)生，CASP3的表達顯著增加[14]。促凋亡信號激活啟動半胱天冬酶，進而激活效應(yīng)半胱天冬酶，例如CASP3，半胱天冬酶的順序激活導(dǎo)致底物蛋白的切割和DNA分子的分解，進而導(dǎo)致細胞凋亡，CASP3在凋亡機制中起著核心作用[15,16]。MYC是一種神秘的癌基因，因為它似乎影響所有的細胞過程，最突出的是細胞代謝和核糖體生物發(fā)生。MYC觸發(fā)選擇性基因表達擴增，以促進細胞生長和增殖。MYC通過其目標協(xié)調(diào)營養(yǎng)物質(zhì)的獲取，以產(chǎn)生ATP和關(guān)鍵的細胞構(gòu)建模塊，這些模塊增加細胞質(zhì)量并觸發(fā)DNA復(fù)制和細胞分裂[17]，有研究表明C-myc的表達與肝硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[18]。p53蛋白阻止應(yīng)激細胞分裂或?qū)е滤鼈兘?jīng)歷程序性細胞死亡。p53蛋白被認為是細胞應(yīng)激的保護者，已經(jīng)被廣泛研究，并且被確定為腫瘤抑制因子。然而，對p53在腫瘤抑制以外的其他作用知之甚少。值得注意的是，最近的報告證明p53參與了某些類型肝細胞損傷的分子機制[19]。轉(zhuǎn)錄因子JUN是肝臟再生的核心基因，也是潛在的治療靶點，未來需要對肝再生進行系統(tǒng)的研究，以更好地確定潛在的機制[20]。

為了進一步探討和驗證靶點預(yù)測的準確性，從GEO下載肝硬化相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)，篩選肝硬化患者和健康對照組之間的差異表達基因：例如MIR128-1、SNORD117、SNORD110、SNORD35B、NORD61等，可作為肝硬化的潛在靶基因，之后與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果比對，獲得18個共有靶基因：ADH1C、CASP3、DRD1、AR、KDR、CA2、MED1、NR3C2、JUN、ESR1、PRKCA、ESR2、NOS2、NR1H4、GFI1、VDR、CYP27A1、SLC6A3；這些潛在靶點可能為下瘀血湯主要活性成分治療肝硬化的潛在關(guān)鍵靶基因。

本研究發(fā)現(xiàn)核心基因的GO功能富集主要涉及類固醇代謝及合成、維生素生物代謝及合成、DNA模板轉(zhuǎn)錄起始、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始等生物過程，這些基本生物學(xué)過程和功能體現(xiàn)在下瘀血湯活性成分調(diào)節(jié)對應(yīng)靶基因和具體通路過程中。關(guān)于KEGG通路富集，主要包括涉及p53信號通路、乙型肝炎、丙型肝炎、細胞凋亡、神經(jīng)變性的途徑-多種疾病、IL-17信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等。其中細胞凋亡是肝損害分子機制中的第一個細胞反應(yīng)，研究表明，有的中藥提取物可顯著減少細胞中細胞存亡調(diào)控蛋白(CASP3等)的表達，抑制細胞凋亡，從而進一步減少肝細胞壞死，減緩肝纖維化進程，阻斷肝細胞凋亡途徑[21]。NF-κB是一類機體內(nèi)參與免疫、炎癥反應(yīng)，維持細胞功能的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)細胞因子、趨化因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子等多種物質(zhì)的表達，與免疫應(yīng)激、細胞增殖、生長分化、細胞周期及凋亡有密切聯(lián)系，可以阻止肝星狀細胞(HSC)凋亡和促進HSC存活與增殖。MAPK信號通路能夠通過HSC活化、增殖、凋亡以及細胞周期參與肝纖維化的形成與逆轉(zhuǎn)[22]。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法研究下瘀血湯治療肝硬化的作用機制，發(fā)現(xiàn)下瘀血湯能夠通過多成分、多靶點、多種生物途徑及多條通路達到治療肝硬化的目的，為進一步從下瘀血湯中提取有效活性成分治療肝硬化提供了理論依據(jù)。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)存在一定的局限性，有待進一步設(shè)計嚴格的動物實驗及臨床試驗驗證其作用機制。