索小英 伊鴻鵬 綦真真 隋娟娟

1.東營(yíng)市人民醫(yī)院感染性疾病科 (山東 東營(yíng)， 207091) 2.東營(yíng)市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心

丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)雙重感染是常見(jiàn)內(nèi)科疾病類型，可加重肝臟疾病進(jìn)展，增加肝硬化、肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，危害患者生命健康，因此及時(shí)給予抗病毒治療意義重大[1，2]。聚乙二醇干擾素α-2a(PEG-IFNα-2a)系聚乙二醇與重組干擾素α-2a結(jié)合形成的長(zhǎng)效干擾素，可結(jié)合細(xì)胞表面特異性受體，激活基因轉(zhuǎn)錄，抑制感染細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制，并調(diào)節(jié)免疫，是治療HCV肝炎可選擇的藥物，故成為HCV和HBV雙重感染的治療選擇之一[3-5]。近年來(lái)中醫(yī)聯(lián)合西醫(yī)治療慢性病毒性肝炎的報(bào)道較多，已被證實(shí)能增強(qiáng)療效，但中醫(yī)學(xué)重視辨證論治，且中醫(yī)藥種類豐富多樣，如何配伍提高療效仍有待探討[6-8]。本研究前期的小樣本量研究證實(shí)，金匱腎氣丸輔助PEG-IFNα-2a治療HCV和HBV雙重感染安全有效，但需大樣本量進(jìn)一步論證。本研究選取92例HCV和HBV雙重感染的肝炎患者，探討中西醫(yī)聯(lián)合的應(yīng)用價(jià)值，為臨床治療疾病提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2019年7月東營(yíng)市人民醫(yī)院感染性疾病科收治的HCV和HBV雙重感染肝炎患者92例，按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，每組46例。兩組患者年齡23～68歲，組間年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、性別、飲酒史、吸煙史、血紅蛋白(Hb)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、中性粒細(xì)胞(NEUT)、HCV基因型、基線病毒學(xué)情況、合并疾病等一般資料均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。本研究獲我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，患者均對(duì)本研究知情，自愿簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料對(duì)比 [例(%)]

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：西醫(yī)診斷符合HCV和HBV肝炎感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[9,10]；中醫(yī)證型符合脾腎陽(yáng)虛證標(biāo)準(zhǔn)[11]，癥見(jiàn)畏寒喜暖，精神疲憊，四肢不溫，面色不華或晦黃，少腹腰膝冷痛，食少脘痞，腹脹便溏或晨泄，下肢水腫，舌質(zhì)淡，有齒痕，苔白或膩或滑，脈沉細(xì)或沉遲；入組前4周無(wú)相關(guān)藥物應(yīng)用史；Hb>80 g/L；PLT≥80×109/L，NEUT≥1.5×109/L。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嗜肝病毒感染者；失代償期肝硬化者；合并甲狀腺疾病者；吸毒者；自身免疫性肝病者；過(guò)敏體質(zhì)或有相關(guān)藥物過(guò)敏史者；妊娠期、哺乳期者；肝癌等惡性腫瘤者。

1.3 治療方法 兩組患者均給予常規(guī)治療：口服利巴韋林(甘肅省西峰制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H62020889)，體重≤75 kg者900 mg/d，>75 kg者1 200 mg/d，3次/d。對(duì)照組患者在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上皮下注射PEG-IFNα-2a(Roche Pharma(Schweiz)Ltd，批準(zhǔn)文號(hào)S20150054)180 μg/次，1次/周，若PLT<50×109/L或NEUT<0.75×109/L，劑量改為135 μg/次，1次/周。觀察組患者在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上給予PEG-IFNα-2a(方法同對(duì)照組)聯(lián)合口服金匱腎氣丸(浙江天一堂藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z33020538)，8 g/次，2次/d。兩組患者均治療48周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 治療前、治療24周和48周后分別采集患者肘部空腹靜脈血5 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-25℃保存，并用抗凝管重復(fù)采集5 ml空腹靜脈血，采用全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特DXC800型)檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBil)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、層黏蛋白(LN)、Toll樣受體4(TLR4)水平，試劑盒購(gòu)于美國(guó)羅氏公司。取抗凝血標(biāo)本，采用流式細(xì)胞儀(美國(guó)B-D公司的FACSCanto)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)與輔助性T細(xì)胞17(Th17)。①Th17檢測(cè)：取抗凝血250 μl，加入RPMI-1640、250×Monensin/BFA、250×PMA/Ionomycin各2 μl，37℃培養(yǎng)箱中5% CO2培養(yǎng)6 h，取孵育好全血100 μl、Anti-Human CD3 PE-Cyanine5 5 μl、Anti-Human CD8a FITC 5 μl，加入FIX&PERM Reagent A 100 μl，室溫靜置15 min，加入PBS 3 ml，混勻，1 250 g離心5 min，棄清液，加入FIX&PERM Reagent B 100 μl、Anti-Human IL-17A PE、Mouse IgGl K Isotype Control PE 5μl，混勻靜置20 min，加入PBS 3 ml，混勻，1 250 g離心5 min，棄清液，加入PBS 0.5 ml，混勻后即刻上機(jī)檢測(cè)。②Treg檢測(cè)：加入抗人FITC-anti-CD4和APC-anti-CD25抗體，4℃避光孵育0.5 h，加入2 ml流式細(xì)胞染色液、1 ml Foxp3，吹打混勻，并加入2.5 μl PE-anti-human Foxp3，4℃避光孵育0.5 h，1 250 g離心5 min，棄清液，加入PBS 3 ml，混勻，1 250 g離心5 min，上清液棄去，加入PBS 0.5 ml，混勻后即刻上機(jī)檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo) ①病毒學(xué)應(yīng)答情況：HCV：分為快速病毒學(xué)應(yīng)答(RVR)、早期病毒學(xué)應(yīng)答(EVR)、治療結(jié)束時(shí)病毒學(xué)應(yīng)答(ETR)，分別于治療4 、12周時(shí)、治療結(jié)束時(shí)檢測(cè)HCV RNA定性陰性或定量檢測(cè)較基線降低>2 lg IU/mL；HBV：完全病毒學(xué)應(yīng)答(CVR)即檢測(cè)不到血清HBV DNA或低于檢測(cè)下限，部分病毒學(xué)應(yīng)答(PVR)即HBV DNA較基線下降≥2 lg IU/ml。②治療前、治療24周和48周后中醫(yī)證候積分：包括畏寒肢冷、腰膝酸軟、下肢水腫、倦怠無(wú)力、肝區(qū)隱痛、食欲不振，均按照無(wú)、輕、中、重依次取0、1、2、3分。比較兩組患者治療前、治療24周和48周后肝功能指標(biāo)(ALT、AST、TBil)和肝纖維化指標(biāo)(HA、Ⅳ-C、PCⅢ、PCⅢ)水平。③治療前、治療24周和48周后TLR4、Treg/Th17。④不良反應(yīng)發(fā)生率。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者病毒學(xué)應(yīng)答情況 觀察組患者失訪2例，對(duì)照組患者失訪3例。兩組患者HCV病毒學(xué)RVR、EVR比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組患者HCV病毒學(xué)ETR及HBV病毒學(xué)CVR高于對(duì)照組患者(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組患者病毒學(xué)應(yīng)答情況比較 [例(%)]

2.2 兩組患者中醫(yī)證候積分 見(jiàn)表3。

表3 兩組患者中醫(yī)證候積分比較分)

2.3 兩組患者肝功能和肝纖維化指標(biāo) 見(jiàn)表4。

表4 兩組患者肝功能和肝纖維化指標(biāo)比較

2.4 兩組患者TLR4、Treg/Th17水平 見(jiàn)表5。

表5 兩組患者TLR4、Treg/Th17比較

2.5 兩組患者不良反應(yīng) 對(duì)照組患者出現(xiàn)1例咽干，2例出現(xiàn)疲乏感，不良反應(yīng)發(fā)生率為6.98%；觀察組患者1例疲乏感，不良反應(yīng)發(fā)生率為2.27%。組間不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.287，P=0.592)。

3 討論

PEG-IFNα-2a是治療HCV、HBV感染的常用藥物。段軍民等[12]報(bào)道，PEG-IFNα-2a治療HCV 24周和48周時(shí)血清HCV RNA轉(zhuǎn)陰率分別為60.34%、72.41%，康曉等[13]報(bào)道，PEG-IFNα-2a治療HBV時(shí)，HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率為86.7%，但在HCV和HBV雙重感染中的應(yīng)用較少。本研究發(fā)現(xiàn)，單純依賴PEG-IFNα-2a治療HCV和HBV雙重感染時(shí)，HCV病毒學(xué)ETR為79.07%、HBV病毒學(xué)CVR為58.14%，仍存在較大提升空間，故考慮聯(lián)合治療。

本研究結(jié)果顯示，觀察組患者HCV病毒學(xué)ETR及HBV病毒學(xué)CVR高于對(duì)照組患者，治療24周和48周后畏寒肢冷、腰膝酸軟、下肢水腫、倦怠無(wú)力、肝區(qū)隱痛、食欲不振中醫(yī)證候積分及ALT、AST、TBil均低于對(duì)照組患者，表明金匱腎氣丸輔助PEG-IFNα-2a治療肝炎HCV和HBV雙重感染兩種方案聯(lián)合能增強(qiáng)病毒抑制效果，有效改善患者癥狀、體征和肝功能。肝腎同源，肝病日久損及脾腎，而腎為先天之本和臟腑氣機(jī)之源，脾胃為后天之本，肝木乘脾，脾陽(yáng)不足，從而出現(xiàn)陽(yáng)氣虛衰，陰寒內(nèi)盛，血運(yùn)不暢，故治以溫補(bǔ)脾腎。金匱腎氣丸來(lái)源于張仲景《金匱要略》，被歷代醫(yī)家稱為“千古補(bǔ)腎陽(yáng)之祖方”，方中桂附溫補(bǔ)命門之火，達(dá)“益火之源，以消陰翳”之功；山茱萸、山藥、熟地同補(bǔ)腎之精氣；丹皮活血化瘀，茯苓、澤瀉通利水道；肉桂、附子化氣行水，溫補(bǔ)腎陽(yáng)，微微生火，即生腎氣，使陽(yáng)有所溫，瘀有所化，因此可提高療效[14,15]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，金匱腎氣丸含有多種有效成分，能增加機(jī)體免疫功能，提高對(duì)嗜肝病毒的抑制效果，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝細(xì)胞[16-18]?？梢?jiàn)金匱腎氣丸與PEG-IFNα-2a聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)，故療效顯著。

肝硬化是HCV和HBV肝炎患者的常見(jiàn)并發(fā)癥，且是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的重要誘因，而肝纖維化是其必經(jīng)環(huán)節(jié)，表現(xiàn)為肝臟細(xì)胞外基質(zhì)沉積、增生，肝竇毛細(xì)血管和肝小葉纖維化，故抑制或改善肝纖維化至關(guān)重要[19,20]。HA是肝細(xì)胞急慢性損傷的標(biāo)志物之一，肝臟受損時(shí)，其含量可增高[21]。Ⅳ-C是組織基底膜構(gòu)成的主要成分，能反映基質(zhì)膠原合成狀態(tài)[22]。PCⅢ在肝纖維化過(guò)程中合成活躍，與肝組織纖維化程度有關(guān)[23]。LN可反映基質(zhì)膠原更新率，可反映肝纖維化活動(dòng)情況[24]。本研究顯示，觀察組患者治療24周和48周后HA、Ⅳ-C、PCⅢ、LN低于對(duì)照組患者，提示金匱腎氣丸輔助PEG-IFNα-2a治療肝炎HCV和HBV雙重感染脾腎陽(yáng)虛證能改善肝纖維化情況，有利于延緩肝硬化進(jìn)程，增強(qiáng)抗病毒效果，能保護(hù)相關(guān)肝細(xì)胞。

CD4+T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)重要組成部分，其中Treg、Th17是CD4+T淋巴細(xì)胞兩種類型，包含特異細(xì)胞膜表面分子和核轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[25,26]。資料顯示，Treg/Th17在HBV感染、HCV感染中起到重要作用，在嗜肝病毒刺激下，肝細(xì)胞中半乳糖凝集素等表達(dá)增加，誘導(dǎo)了Treg細(xì)胞分化，表現(xiàn)為Treg細(xì)胞數(shù)量增加，抑制HCV、HBV特異性T細(xì)胞的增殖，免疫抑制作用增強(qiáng)，且Th17減少，免疫功能降低，造成病毒無(wú)法清除與病情的遷延[27,28]。TLR4具有免疫調(diào)節(jié)作用，可識(shí)別、結(jié)合內(nèi)毒素，誘導(dǎo)核因子活化，并能激活靶基因轉(zhuǎn)錄，釋放促炎介質(zhì)，從而引起肝細(xì)胞損傷[29]。本研究顯示，金匱腎氣丸輔助PEG-IFNα-2a治療能降低TLR4、Treg細(xì)胞、Treg/Th17，糾正機(jī)體免疫失衡狀態(tài)，有利于保護(hù)肝細(xì)胞，且安全可靠。本研究不足之處在于，受限于實(shí)際情況，治療周期較長(zhǎng)，兩組均有失訪病例，可能造成數(shù)據(jù)偏倚，有待后續(xù)的進(jìn)一步探討。

綜上所述，金匱腎氣丸輔助PEG-IFNα-2a治療肝炎HCV和HBV雙重感染脾腎陽(yáng)虛證，能增強(qiáng)病毒抑制效果，有效改善患者癥狀體征和肝功能，抑制肝纖維化，調(diào)節(jié)免疫功能，安全可靠。