包華鑫 孫元鵬

早期胃癌主要是指胃癌浸潤深度在胃黏膜層或者是黏膜下層，研究結(jié)果顯示早期胃癌患者5年存活率達(dá)90%以上，目前我國早期胃癌患者發(fā)現(xiàn)率較低，大部分患者一旦發(fā)現(xiàn)已經(jīng)處于晚期，雖然我國手術(shù)、放療、化療效果不斷提升，但是胃癌患者5年生存率只占40%[1-2]。臨床中關(guān)于胃癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，公認(rèn)幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是導(dǎo)致胃癌發(fā)病的主要原因[3]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）家族屬于一種模式識(shí)別受體，在機(jī)體免疫中發(fā)揮調(diào)節(jié)適應(yīng)免疫作用，參與多種炎癥相關(guān)惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程，在細(xì)胞損傷、組織重構(gòu)及修復(fù)過程中常常作為傳感器[4-5]。糖原合成酶激酶 -3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶其具有多功能作用，參與糖代謝、細(xì)胞增殖、凋亡等過程，并且在多種腫瘤中顯示異常表達(dá)[6]。目前缺少GSK3β、TLR-4表達(dá)與胃癌Hp感染的相關(guān)研究。鑒于此，本研究回顧性分析海安市中醫(yī)院收治的94例早期胃癌患者臨床資料，探討GSK3β、TLR-4表達(dá)與早期胃癌患者Hp感染的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本文選取2018年11月-2020年11月在本院就診的早期胃癌患者94例，納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)過胃鏡、病理學(xué)檢查確診為胃癌；患者臨床分為Ⅰ、Ⅱ期；患者均符合文獻(xiàn)[7]中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化內(nèi)鏡學(xué)分會(huì)制定的中關(guān)于早期胃癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；進(jìn)行放療、化療抗腫瘤治療；妊娠期、哺乳期患者；精神異常；合并其他感染性疾??；近1個(gè)月服用抗生素、質(zhì)子泵抑制劑、鉍制劑等藥物。早期胃癌患者中，男60例，女34例，年齡 35～70 歲，BMI 21～26 kg/m2；其中 Hp 感染陽性40例為陽性胃癌組，Hp感染陰性54例為陰性胃癌組。選取同時(shí)期在本院健康體檢正常志愿者30例為對(duì)照組，男20例，女10例，年齡32～70歲，BMI 20～25 kg/m2。三組性別、年齡、BMI、胃癌家族史等臨床基線資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。陽性胃癌組與陰性胃癌組病灶直徑、病灶位置等基線資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性，見表2。本文研究患者及其家屬均知情，簽署知情同意書，研究經(jīng)過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 三組臨床基線資料比較

表2 陽性胃癌組與陰性胃癌組基線資料比較

表2（續(xù)）

1.2 方法

采用13C呼氣法檢測患者Hp感染：患者在檢查前1個(gè)月停止服用抗生素、質(zhì)子泵抑制劑、鉍制劑等藥物，在患者空腹下進(jìn)行，檢查前患者先在集氣袋中吹氣，之后口服13C膠囊，25 min后，患者向另一個(gè)集氣袋中吹氣，通過13C檢測呼吸儀觀察患者Hp感染結(jié)果。采集三組研究對(duì)象入院當(dāng)天空腹肘部靜脈血 3 ml，2 000 r/min 離心處理 5 min，轉(zhuǎn)速為 2 000 r/min 離心干預(yù) 5 min，-20 ℃保持。采集到的血液標(biāo)本，通過1 000 r/min離心處理后提取沉淀，滴加裂解液、反復(fù)凍融后，120 000 r/min離心處理，提取上清液，采用酶標(biāo)儀檢測GSK3β、TLR-4蛋白濃度，保存。滴加10%的分離膠，封閉，吸干水分，給予5%的濃縮膠灌注，凝固后，將其在電泳槽中固定，加5μl Marker、變性蛋白樣品，電泳干預(yù)30 min，待蛋白分離膠底，結(jié)束電泳；轉(zhuǎn)膜成功后將硝酸纖維素膜（nitrocellulosefilter membrane，NC）膜在5%的脫脂奶粉中封閉固定1 h，加一抗（GSK3β、TLR-4 1∶1 000）孵育，經(jīng)過震蕩洗膜后加二抗（GSK3β、TLR-4 1∶10 000），孵育，再次震蕩洗膜，使用紅外熒光成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果給予分析。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，組間兩兩對(duì)比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)；以率（%）表示計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operator characteristics，ROC）曲線分析GSK3β、TLR-4對(duì)早期胃癌患者Hp感染的預(yù)測價(jià)值；相關(guān)性采用Spearman分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSK3β、TLR-4表達(dá)比較

與對(duì)照組相比，陽性胃癌組、陰性胃癌組GSK3β表達(dá)高，TLR-4表達(dá)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與陰性胃癌組相比，陽性胃癌組GSK3β表達(dá)高，TLR-4表達(dá)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 3。

表3 三組GSK3β、TLR-4表達(dá)比較（±s）

表3 三組GSK3β、TLR-4表達(dá)比較（±s）

*與對(duì)照組相比，P＜0.05；#與陰性胃癌組相比，P＜0.05。

組別 GSK3β TLR-4陽性胃癌組（n=40） 1.35±0.15*# 0.43±0.09*#陰性胃癌組（n=54） 1.02±0.10* 0.86±0.08*對(duì)照組（n=30） 0.45±0.05 1.16±0.25 F值 47.290 25.626 P值 0.001 0.001

2.2 GSK3β、TLR-4對(duì)早期胃癌患者Hp感染的預(yù)測價(jià)值

ROC曲線分析血清GSK3β、TLR-4預(yù)測早期胃癌患者Hp感染的曲線下面積（area under the curve，AUC） 分 別 為 0.745（95%CI：0.648，0.842，P=0.001）、0.721（95%CI：0.619，0.821，P=0.001），見表4、圖1。

表4 GSK3β、TLR-4診斷早期胃癌患者Hp感染的效能

圖1 GSK3β、TLR-4診斷早期胃癌患者Hp感染的ROC曲線

2.3 GSK3β、TLR-4表達(dá)與早期胃癌患者Hp感染的相關(guān)性

采用Spearman相關(guān)性分析，以1表示Hp感染為陰性，以2表示Hp感染為陽性。GSK3β表達(dá)與Hp感染呈正相關(guān)（r=0.483，P=0.001）；TLR-4表達(dá)與Hp感染呈負(fù)相關(guān)（r=-0.538，P=0.001）。

3 討論

大部分早期胃癌患者臨床表現(xiàn)不明顯，所以導(dǎo)致早期胃癌患者檢出率較低，在臨床中主要通過胃鏡直接觀察患者胃黏膜狀況，診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)是病理組織學(xué)檢測，但是其具有侵入性、價(jià)格高等缺點(diǎn)，部分患者依從性、耐受性較差，因此選擇操作簡單、無創(chuàng)、敏感性高的檢查手段對(duì)患者來說至關(guān)重要[8-9]。本研究通過ROC曲線，GSK3β、TLR-4表達(dá)均與早期胃癌患者Hp感染的獨(dú)立相關(guān)，提示GSK3β、TLR-4表達(dá)可以作為臨床預(yù)測早期胃癌Hp感染的預(yù)測指標(biāo)。

Hp在患者胃黏膜損傷中屬于一種攻擊性因子，一旦革蘭陰性菌發(fā)生繁殖和崩解會(huì)釋放大量的脂多糖，將免疫系統(tǒng)激活，發(fā)揮著雙重作用：一方面對(duì)感染有一定的抵御作用；另一方面是對(duì)組織產(chǎn)生一定的損傷[10-11]。Hp感染導(dǎo)致癌癥發(fā)生的途徑較多，主要是加快硝酸鹽向亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變進(jìn)程，從而將胃黏膜環(huán)境改變，產(chǎn)生大量的細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（CagA）、空泡毒素A（VacA）等毒性物質(zhì)[12]。

研究數(shù)據(jù)顯示，在腫瘤細(xì)胞中有TLRs表達(dá)，TLRs信號(hào)參與腫瘤免疫逃逸、發(fā)展過程，與機(jī)體炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[13]。TLR-4主要存在于巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表面，發(fā)揮免疫作用。本研究中陽性、陰性早期胃癌患者血清TLR-4表達(dá)較高，其中陽性早期胃癌患者TLR-4表達(dá)高于陰性早期胃癌患者，提示早期胃癌患者TLR-4表達(dá)異常是導(dǎo)致早期胃癌患者Hp感染的危險(xiǎn)因素，增加Hp感染風(fēng)險(xiǎn)。胃癌細(xì)胞不斷增殖會(huì)導(dǎo)致大量正常細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡，釋放大量的TLRs配體，TLRs會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生刺激，死亡細(xì)胞發(fā)生“sterile”炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致患者病情不斷發(fā)展[14-15]。Li等[16]研究認(rèn)為，在胃黏膜細(xì)胞表面存在的TLR4 mRNA能激活Hp的脂多糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)換生長因子β活化酶發(fā)生磷酸化，提示Hp通過調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起慢性萎縮性胃炎胃黏膜表面上皮細(xì)胞壞死速度加快。本研究ROC分析顯示TLR-4預(yù)測早期胃癌Hp感染的AUC達(dá)0.721，敏感度和特異度分別為92.50%、57.40%，提示血清TLR-4可用于評(píng)估早期胃癌Hp感染發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

在腫瘤研究結(jié)果中，GSK-3β在Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信號(hào)通路中均有重要的參與作用，對(duì)磷酸化/去磷酸化過程發(fā)揮活性調(diào)節(jié)作用[17-18]。也有研究指出GSK-3β具有雙向調(diào)節(jié)作用，GSK-3β通過調(diào)節(jié)p53基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)正常細(xì)胞生長有一定的抑制作用；此外，通過對(duì)維持NF-κB表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)正常細(xì)胞生長[19]。本研究陽性胃癌患者血清GSK3β表達(dá)低于陰性胃癌患者和對(duì)照組，且GSK3β表達(dá)與早期胃癌患者Hp感染存在密切關(guān)系，提示血清CysC水平升高是導(dǎo)致早期胃癌患者Hp感染的危險(xiǎn)因素。楊學(xué)麗等[20]研究指出，GSK3β低表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，加快解聚APC/GSK3β/β-catenin復(fù)合物，造成β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)不斷積聚、活化，導(dǎo)致胃癌不斷轉(zhuǎn)移、浸潤。本研究ROC曲線分析顯示GSK3β預(yù)測早期胃癌Hp感染的AUC達(dá)0.745，提示GSK3β是早期胃癌Hp感染的警示指標(biāo)。

本文Spearman研究結(jié)果證實(shí)，TLR-4表達(dá)水平與Hp感染呈負(fù)相關(guān)。蔡兆根等[21]研究指出，在Hp感染胃黏膜上皮組織中TLR4陽性表達(dá)占83.53%，提示Hp感染與TLR4呈正相關(guān)，提示胃癌患者Hp感染伴隨TLR-4介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答發(fā)生。本文研究結(jié)果與其研究不一致，分析原因，本文旨在研究早期胃癌患者血清中TLR-4表達(dá)水平變化狀況，未研究患者免疫組化狀況。本文中，GSK3β表達(dá)水平與Hp感染呈正相關(guān)。

綜上所述，早期胃癌Hp感染患者GSK3β、TLR-4表達(dá)異常，GSK3β、TLR-4表達(dá)水平高低與Hp感染具有相關(guān)性，GSK3β、TLR-4是早期胃癌Hp感染的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因子。