吳永玲，魏 景，孟銀鳳，李俊偉

（1.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西 商洛 726000）

蛇床子［Cnidium monnieri（L.）Cuss.］為傘形科植物蛇床成熟后的干燥果實(shí)，主要分布于中國(guó)華東、中南、西南、西北等地［1］。現(xiàn)代研究表明，蛇床子中含有多種活性成分，其中以蛇床子素、香豆素及黃酮類成分為主，具有殺蟲(chóng)抑菌、止癢、抗心律失常、抗血栓、抗腫瘤和骨質(zhì)疏松等藥理作用，成為國(guó)際上天然藥物開(kāi)發(fā)利用的熱點(diǎn)［2，3］。但目前蛇床子中的主要成分及藥理研究集中在蛇床子素上［4-6］，對(duì)其中的黃酮類化合物研究報(bào)道較少。如果能進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用蛇床子中的黃酮類物質(zhì)，這對(duì)蛇床子植物的發(fā)展將具有一定現(xiàn)實(shí)意義。

同時(shí)，近些年農(nóng)作物病蟲(chóng)害的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，產(chǎn)生嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留及抗藥性問(wèn)題［7，8］，而市場(chǎng)上商品化的生物源農(nóng)藥往往只具備一種農(nóng)用活性，給病蟲(chóng)害混合發(fā)生的藥劑施用帶來(lái)諸多不便。開(kāi)發(fā)兼具殺蟲(chóng)抑菌活性的生物源農(nóng)藥已成為開(kāi)發(fā)綠色、安全、便捷食品的必要措施［9］。

天然產(chǎn)物中有效成分的提取方法多為超聲輔助提?。?0］、膜分離提取等［11］，并結(jié)合正交設(shè)計(jì)或響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化［12］。響應(yīng)面設(shè)計(jì)在工藝優(yōu)化與混料設(shè)計(jì)上應(yīng)用廣泛，具有試驗(yàn)操作簡(jiǎn)潔、模型選擇廣、預(yù)測(cè)精度高等特點(diǎn)［13，14］。因此，本研究采取傳統(tǒng)的乙醇浸提法，結(jié)合提取單因素分析及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，以期開(kāi)發(fā)出提取率高、經(jīng)濟(jì)成本低的蛇床子總黃酮最佳提取工藝，同時(shí)對(duì)提取物的殺蟲(chóng)和抑菌活性進(jìn)行研究，為蛇床子植物和生物源農(nóng)藥的深層次開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料供試樣品：蛇床子果實(shí)（購(gòu)自商洛市中藥材商店），試驗(yàn)前烘干后粉碎備用。

主要試劑：乙醇（分析純）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、NaOH（分析純），上海阿拉丁試劑公司。

供試?yán)ハx(chóng)：蘋果黃蚜（Hyalopterus amygdali）、朱砂葉螨（Tetranychina harti）分別采集于商洛學(xué)院蘋果樹(shù)和玉米葉上，經(jīng)商洛學(xué)院生物學(xué)院孟銀鳳博士鑒定為蘋果黃蚜、朱砂葉螨。

供試菌種：甘藍(lán)黑斑病菌（Broccoli and Purple cabbage bacterial leaf spot）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosprioidesPenz）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、蘋果腐爛病菌（Cytosporasp.）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearumSchw）及水稻紋枯病菌（Thanatephorus cucumeris）均來(lái)源于西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心。

1.1.2 主要儀器BJ-300型粉碎機(jī)（廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司），S-114型電子天平（上海精科實(shí)業(yè)有限公司），SHB-IIIA型循環(huán)水式真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），UV-765B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海雙旭電子有限公司），KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司），YXQ-LS-18SI型高壓滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），LRH-70F型生化培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 蛇床子總黃酮的提取精密稱取10 g烘干粉碎后的蛇床子，用無(wú)水乙醇浸泡，采用浸提法得到提取液，過(guò)濾，取上清液，得到蛇床子提取液。

1.2.2 對(duì)照品溶液的配制精密稱取120℃干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg于100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度線，即得0.2 mg∕mL蘆丁對(duì)照品溶液［15］。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制量取蘆丁對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL和5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加水至5 mL，加入5% NaNO2溶液1.0 mL，混勻后放置6 min，加入10% Al（NO3）3溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，再加入4% NaOH溶液10.0 mL，加水至刻度線，搖勻，放置15 min。以第一組試劑作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)510 nm處，分別測(cè)定系列濃度溶液的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 總黃酮得率的測(cè)定采用硝酸鋁顯色法測(cè)定蛇床子總黃酮類物質(zhì)的含量，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定提取液在波長(zhǎng)510 nm處的吸光度。

1.2.5 單因素試驗(yàn)每組精密稱取10 g蛇床子，以黃酮得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采取單因素法研究不同溶劑體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、提取時(shí)間（15、20、25、30、35 min）、提取溫度（40、50、60、70、80℃）和乙醇體積（50、75、100、125、150 mL）4個(gè)因素對(duì)黃酮提取率的影響，研究其中一個(gè)因素的影響時(shí)其他因素作為基礎(chǔ)水平。以單因素為橫坐標(biāo)，提取率為縱坐標(biāo)，繪出每個(gè)因素對(duì)蛇床子總黃酮得率的影響折線圖。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，每組精密稱取5 g蛇床子，采用Box-Behnken因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以蛇床子總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取影響黃酮提取率較顯著的因素，優(yōu)化蛇床子黃酮類物質(zhì)提取工藝條件（表1）。采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素及水平

1.2.7 殺蟲(chóng)活性測(cè)定試驗(yàn)采用梯度稀釋法，將蛇床子提取物分別稀釋為100.0、10.0、1.0 mg∕mL的供試藥劑進(jìn)行殺蟲(chóng)活性測(cè)定。

1）對(duì)蘋果黃蚜的毒殺活性測(cè)定［16］

采用浸蟲(chóng)浸葉法：將帶有蘋果黃蚜的蘋果葉片采下，挑選大小基本一致、健康的無(wú)翅成蚜作為試蟲(chóng)，用毛筆剔除不合格蟲(chóng)體，每片葉上至少保留30只蚜蟲(chóng)，將帶有試蟲(chóng)的葉片在配好的藥液中浸漬3～5 s取出，濾紙吸干蟲(chóng)體及葉片周圍的多余藥液，處理后的葉片置于9 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中預(yù)先鋪上濾紙保濕，每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)30頭試蟲(chóng)。滴水保濕，24 h后檢查試蟲(chóng)死亡數(shù)（毛筆輕觸蟲(chóng)體，不動(dòng)即視為死亡），以0.5%表面活性劑（吐溫-80）水溶液作為空白對(duì)照，計(jì)算死亡率以及校正死亡率。計(jì)算公式如下所示。

2）對(duì)朱砂葉螨的毒殺活性測(cè)定［17］

采用玻片浸漬法：先將雙面膠一面貼在潔凈的載玻片上1∕3處，用毛筆挑取活動(dòng)力強(qiáng)、個(gè)頭一致的成螨，使其背部粘于貼有雙面膠的載玻片上。粘貼時(shí)要注意使蟲(chóng)體肢體朝上、背部粘膠，螨足可自由活動(dòng)。每玻片粘朱砂螨40頭，2 h后鏡檢觀察，剔除不合格蟲(chóng)體，每玻片至少保留30頭。將粘有朱砂葉螨的載玻片浸入供試藥劑中3～5 s后取出，濾紙吸去玻片周圍多余藥液，以0.5%表面活性劑（吐溫-80）水溶液作為空白對(duì)照，每處理重復(fù)3次，24 h后檢查并統(tǒng)計(jì)死蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算死亡率和校正死亡率。

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's新復(fù)極差法（DMRT）進(jìn)行差異顯著性分析，并計(jì)算蛇床子提取物對(duì)2種試蟲(chóng)的毒力回歸方程、致死中濃度（LC50）及95%置信區(qū)間。

1.2.8 抑菌活性測(cè)定試驗(yàn)蛇床子總黃酮提取液對(duì)7種植物病原菌的抑制率和EC50采用生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定［18，19］。配制濃度為10 000 μg∕mL的蛇床子總黃酮母液，取1 mL母液加入100 mL的PDA培養(yǎng)基中混合均勻即制成100 mg∕L含藥培養(yǎng)基，然后分別將菌餅接種到含藥培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，設(shè)置空白對(duì)照，置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測(cè)得供試菌的生長(zhǎng)直徑，計(jì)算抑菌率。根據(jù)抑菌率的結(jié)果選擇合適的濃度進(jìn)行倍半稀釋，配制系列濃度含藥溶液，再采用生長(zhǎng)速率法對(duì)7種病原菌進(jìn)行抑菌率測(cè)定，求出毒力回歸方程，并計(jì)算EC50。抑菌率計(jì)算公式如下所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=2.251x+0.001 6。因R2=0.992 1接近1，表明蘆丁濃度與吸光度二者之間線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)考察結(jié)果

單因素試驗(yàn)中各因素對(duì)蛇床子總黃酮得率的影響見(jiàn)圖1。

2.2.1 溶劑濃度對(duì)蛇床子中黃酮類物質(zhì)提取率的影響由圖1a可知，總黃酮得率在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～60%時(shí)增加較快，最大值為9.22%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%后總黃酮類物質(zhì)的得率逐漸下降，這可能與脂溶性物質(zhì)溶解量有關(guān)。因此，可以確定60%為超聲提取蛇床子總黃酮的最佳溶劑體積分?jǐn)?shù)。

圖1 單因素試驗(yàn)中各因素對(duì)蛇床子總黃酮得率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)蛇床子中黃酮類物質(zhì)提取率的影響由圖1b所示，在提取時(shí)間為15～25 min時(shí)黃酮提取率呈上升趨勢(shì)，黃酮得率最大為13.56%。25 min后總黃酮得率逐漸下降，這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間越長(zhǎng)，蛇床子和乙醇溶液接觸越充分以致總黃酮類化合物溶出較多，已溶出的黃酮類物質(zhì)可能會(huì)隨其他大分子溶出或降解，故蛇床子總黃酮類物質(zhì)的最佳提取時(shí)間為25 min。

2.2.3 提取溫度對(duì)蛇床子中黃酮類物質(zhì)提取率的影響由圖1c所示，提取溫度為40～60℃時(shí)，蛇床子總黃酮的得率逐漸增大，且黃酮得率最大為6.64%。當(dāng)溫度高于60℃時(shí)開(kāi)始下降，這可能與蛇床子中黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)隨溫度升高而破壞有關(guān)，故蛇床子總黃酮最佳提取溫度應(yīng)為60℃。

2.2.4 溶劑體積對(duì)蛇床子中黃酮類物質(zhì)提取率的影響由圖1d所示，在溶劑體積為50～100 mL時(shí)黃酮提取率呈上升趨勢(shì)，黃酮得率最大為23.88%。溶劑體積大于100 mL后黃酮得率逐漸下降，這可能是因?yàn)槿軇w積越大時(shí)，溶液與之接觸越充分，導(dǎo)致其他大分子物質(zhì)溶出，使黃酮類物質(zhì)提取率降低，故蛇床子總黃酮類物質(zhì)的最佳提取溶劑體積為100 mL。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇Design-Expert V 8.0.6.1執(zhí)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)模型，固定提取溫度為60℃，以蛇床子黃酮得率（Y）與溶劑體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、溶劑體積（C）建立回歸模型，對(duì)表2中響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多次回歸擬合，得到回歸方程：Y=7.72-1.09A+0.29B-1.72C-0.22AB+0.81AC+0.65BC-2.29A2-1.84B2-1.23C2。

表2 蛇床子黃酮提取率響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由表3所示，模型達(dá)到極顯著水平（回歸模型P＜0.000 1），同時(shí)方程失擬項(xiàng)P=0.115 5，表明模型選擇可靠、預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相差不大，故可用此模型分析和預(yù)測(cè)影響蛇床子中黃酮提取率的3個(gè)因素變化規(guī)律。從模型顯著水平可以得出，蛇床子黃酮提取率的影響因素為：C（溶劑體積）＞A（溶劑體積分?jǐn)?shù)）＞B（提取時(shí)間），表明這3個(gè)因素均與蛇床子黃酮提取率有一定相關(guān)性，其中溶劑體積對(duì)蛇床子黃酮提取率的影響極顯著。

表3 回歸模型的方差分析

將模型中A、B和C3個(gè)因素在方差分析的基礎(chǔ)上固定在中間水平上，蛇床子黃酮的得率作為響應(yīng)指標(biāo)［20］，得出其他2個(gè)因素交互作用蛇床子黃酮提取模型，并根據(jù)該模型繪制3D圖。等高線彎曲程度則反映了2因素之間的交互作用大?。?1］，如圖2所示，溶劑體積分?jǐn)?shù)與溶劑體積、溶劑濃度與提取時(shí)間兩兩交互作用對(duì)提取率的影響較大，而溶劑體積與提取時(shí)間作用并不明顯。在3D圖中的最高點(diǎn)可以得到一個(gè)理論最大值，這與方差分析結(jié)果一致。

圖2 2因素相互作用影響蛇床子總黃酮得率的響應(yīng)面效果

2.3.2 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證按照蛇床子總黃酮響應(yīng)面法的試驗(yàn)結(jié)果，得到最佳提取條件下總黃酮得率預(yù)測(cè)值為7.716%，即溶劑體積分?jǐn)?shù)為63.78%，提取時(shí)間為23 min，溶劑體積為84.44 mL?？紤]實(shí)際可操作性，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為溶劑體積分?jǐn)?shù)64%、提取時(shí)間23 min、溶劑體積85 mL，最終黃酮實(shí)際得率為7.83%，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值差異不大，且工藝穩(wěn)定性在重復(fù)性試驗(yàn)下證明有一定可靠性，表明此響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)蛇床子總黃酮的提取有參考價(jià)值。

2.4 殺蟲(chóng)活性測(cè)定結(jié)果

蛇床子提取物對(duì)2種試蟲(chóng)的觸殺活性見(jiàn)表4。分別采用浸蟲(chóng)浸葉法和玻片浸漬法測(cè)定蛇床子提取物對(duì)蘋果黃蚜和朱砂葉螨的觸殺活性，結(jié)果表明蛇床子提取物對(duì)2種試蟲(chóng)均有一定的觸殺活性，且校正死亡率隨提取物濃度的增大而升高。當(dāng)蛇床子提取物濃度為100.0 mg∕mL時(shí)，對(duì)2種試蟲(chóng)的48 h校正死亡率均為100%，在最小濃度1.0 mg∕mL時(shí)，對(duì)2種試蟲(chóng)的的48 h校正死亡率均大于50%，但此濃度下24 h校正死亡率分別為37.86%和28.16%，觸殺活性一般。在10.0、1.0 mg∕mL濃度下2種試蟲(chóng)的同一時(shí)間校正死亡率存在顯著差異，整體來(lái)看，蛇床子提取物對(duì)蘋果黃蚜的觸殺活性優(yōu)于朱砂葉螨。

表4 蛇床子提取物對(duì)2種試蟲(chóng)的觸殺活性

為進(jìn)一步探討蛇床子提取物對(duì)2種試蟲(chóng)的毒力大小，分別測(cè)試并求出2種試蟲(chóng)24、48 h下的致死中濃度和毒力回歸方程。由表5可知，蛇床子提取物48 h對(duì)蘋果黃蚜的毒力最強(qiáng)，致死中濃度（LC50）為0.041 mg∕mL，大于對(duì)朱砂葉螨的毒力（LC50為0.086 mg∕mL）。由此可見(jiàn)，蛇床子提取物對(duì)蘋果黃蚜和朱砂葉螨均表現(xiàn)出一定的毒力，對(duì)蘋果黃蚜的毒力大于朱砂葉螨。

表5 蛇床子提取物對(duì)2種試蟲(chóng)的毒力測(cè)定

2.5 抑菌活性測(cè)定結(jié)果

從表6可以看出，蛇床子提取物對(duì)7種病原菌的生長(zhǎng)均有抑制作用，且抑菌活性不同菌種間存在較大差異。其中蛇床子提取物對(duì)番茄灰霉病菌EC50為21.29 mg∕L，抑制活性最好；對(duì)蘋果腐爛病菌和油菜菌核病菌的EC50分別為35.56、32.27 mg∕L，抑制作用較強(qiáng)；對(duì)其他4種植物病原菌的抑制活性較差，EC50均大于45.00 mg∕L。蛇床子提取物對(duì)這7種植物源病菌的抑制活性從高到低依次為番茄灰霉病菌＞油菜菌核病菌＞蘋果腐爛病菌＞蘋果炭疽病菌＞甘藍(lán)黑斑病菌＞小麥赤霉病菌＞水稻紋枯病菌。

表6 蛇床子黃酮提取物對(duì)7種供試真菌的抑制毒力測(cè)定

3 小結(jié)

本研究通過(guò)浸提法結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化單因素試驗(yàn)的提取工藝，對(duì)蛇床子中的黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，確定最佳提取工藝條件：溶劑無(wú)水乙醇體積分?jǐn)?shù)為64%，提取時(shí)間為23 min，體積為85 mL。最終黃酮實(shí)際得率為7.83%，且實(shí)際值與理論值差異不大。

采用浸蟲(chóng)浸葉法和玻片浸漬法測(cè)定蛇床子提取物對(duì)蘋果黃蚜和朱砂葉螨的觸殺活性，結(jié)果表明，蛇床子提取物濃度為1.0 mg∕mL時(shí)，對(duì)2種試蟲(chóng)的48 h校正死亡率均大于50%；濃度為10.0、1.0 mg∕mL時(shí)，對(duì)2種試蟲(chóng)的校正死亡率存在顯著性差異。同時(shí)，蛇床子提取物對(duì)蘋果黃蚜和朱砂葉螨均表現(xiàn)出一定的毒力，48 h的LC50分別為0.041、0.086 mg∕mL。此外，抑菌活性試驗(yàn)表明，蛇床子提取物對(duì)番茄灰霉病菌的抑制活性最好，對(duì)蘋果腐爛病菌和油菜菌核病菌也具有較強(qiáng)的抑菌活性。

目前農(nóng)作物病蟲(chóng)害的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，產(chǎn)生了嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留和抗藥性問(wèn)題［22］。本研究為生物源農(nóng)藥開(kāi)發(fā)和蛇床子植物的利用提供了一定的理論依據(jù)，但同時(shí)本試驗(yàn)中殺蟲(chóng)抑菌活性均是在室內(nèi)條件下進(jìn)行，與田間試驗(yàn)結(jié)果之間可能存在一定差異［23］，關(guān)于蛇床子提取物在田間實(shí)際環(huán)境因素中的農(nóng)用活性還有待于進(jìn)一步研究。