摘要：高致病性禽流感（HPAD是當(dāng)前對全球家禽養(yǎng)殖業(yè)危害最大的禽類烈性傳染病，不僅涉及養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展、野生動物安全、動物源食品安全，也是全球公共衛(wèi)生的主要問題之一。本文梳理了全球高致病性禽流感流行概況，綜述了禽流感診斷技術(shù)，對臨床診斷及樣品采集、禽流感病毒血清學(xué)檢測技術(shù)等進(jìn)行概述，以期我國HPAl的防疫和控制措施提供參考。

關(guān)鍵詞：禽流感；HPAl;疫病防控；公共衛(wèi)生

1 禽流感病毒的概述

流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA病毒。根據(jù)核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原性的不同，國際病毒分類委員會對流感病毒的最新分類分為α，β，Y和δ四個屬。目前關(guān)注最多是a流感病毒屬，如禽流感病毒等。根據(jù)病毒的致病性，禽流感病毒分為高致病性禽流感病毒（HPAI）和低致病性禽流感病毒（IPAI）[1]。目前來看，絕大多數(shù)禽流感病毒都是低致病性禽流感病毒；少數(shù)H5和H7亞型是高致病性禽流感病毒。

2 高致病性禽流感流行概況

2005-2021年，高致病性禽流感已導(dǎo)致全球3 16億多只家禽死亡和撲殺。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021年，全球共有65個國家和地區(qū)報(bào)告發(fā)生高致病性禽流感（HPAI）疫情4.376起，超1，200萬只禽類被感染，其中約516萬只死亡，至少4. 700萬只被撲殺。

此外，人偶爾也會感染禽流感病毒。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，人感染H5N1亞型約850例，其中約半數(shù)出現(xiàn)死亡；人感染H7N9約1，500例，死亡約600例、感染H5N6病例約80例，死亡約30例。目前，HPAI僅限于H5和H7亞型高致病性禽流感病毒（HPAIV）引起的疫病。禽流感不僅會對養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害，而且會給人類健康帶來巨大威脅[2]。

3 禽流感診斷技術(shù)的綜述

國際上禽流感診斷的依據(jù)是世界動物衛(wèi)生組織出版的WOAH陸生動物法典和WOAH陸生動物診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊。我國對禽流感診斷的依據(jù)主要有國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等，其中重要是2020年發(fā)布實(shí)施的《高致病性禽流感診斷技術(shù)》 （GB/T 18936-2020）國家標(biāo)準(zhǔn)。2020年新修訂的版本比舊版內(nèi)容更系統(tǒng)，增加了流行病學(xué)的臨床診斷，樣品的采集、保存和運(yùn)輸?shù)葍?nèi)容，病毒分離后實(shí)驗(yàn)室鑒定方法包括HA-HI試驗(yàn)、RT-PCR方法以及熒光RT-PCR方法，最后結(jié)合流行病學(xué)特征和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果進(jìn)行綜合判定。此外，有些試驗(yàn)操作過程和注意事項(xiàng)在附錄中體現(xiàn)，其中最重要的2個：一是IVPI測定試驗(yàn)，該試驗(yàn)只能在動物生物安全三級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行；二是血清非特異性凝集和非特異性抑制因子的處理方法，有些禽類血清需要用該方法處理后再進(jìn)行HA和Hl試驗(yàn)。

4 臨床診斷及樣品采集

4.1 關(guān)于樣品采集

開展實(shí)驗(yàn)室診斷的第一步是樣品采集、保存與運(yùn)輸環(huán)節(jié)。考慮到高致病性禽流感對生物安全的要求較高，所以樣品采集應(yīng)注意以下條件：①樣品采集宜在發(fā)病初期選擇具有典型臨床癥狀的禽進(jìn)行，采樣過程中應(yīng)避免交叉污染；②死禽主要采集氣管、肺、腦、肝臟等組織進(jìn)行病毒的檢測、分離；③活禽可以采集咽喉和／或泄殖腔拭子；④采集咽喉拭子時要深入喉頭及上顎裂來回刮蹭并旋轉(zhuǎn)，取分泌液。采集泄殖腔拭子時將拭子深入泄殖腔旋轉(zhuǎn)并沾取少量糞便；⑤血清樣品采集。血清樣本要盡量避免溶血，污染等情況。

4.2 樣品的保存和運(yùn)輸

樣品采集后置保溫箱中，加入預(yù)冷的冰袋，密封，宜24h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室。樣品應(yīng)盡快處理，沒有條件的可在4℃存放不超過4d，也可在低溫條件下保存（-70℃貯存為宜）。如果路途短，可以直接放上冰袋運(yùn)輸，如果路途較遠(yuǎn)，可以放干冰運(yùn)輸。運(yùn)輸?shù)臅r候，按生物安全要求進(jìn)行包裝，防止發(fā)生泄漏。

5 禽流感病毒核酸檢測方面

禽流感屬于高致病性病原，對生物安全的要求較高。首先要選擇有資質(zhì)的高等級生物安全實(shí)驗(yàn)室，采集禽組織（勻漿物）、拭子和糞便等，通過雞胚（9～11日齡）尿囊腔接種的方法進(jìn)行病毒分離。利用HA-HI、IVPI、RT-PCR、熒光RT-PCR等方法做進(jìn)一步鑒定。

5.1 常規(guī)RT-PCR方法

2020版整合了農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《禽流感病毒RT-PCR檢測方法》（NYIT 772-2013），規(guī)定了通用、H5、H7、H9、N1、N2、N9等亞型禽流感病毒的RT-PCR檢測技術(shù)，適用于檢測禽組織、分泌物、排泄物和雞胚尿囊液中禽流感病毒的核酸。

5.2 熒光RT-PCR方法

2020版本整合了4項(xiàng)國家標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了通用、H5、H7、H9、N6、N8、N9等亞型的熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)，適用于檢測禽組織、分泌物、排泄物和雞胚尿囊液中禽流感病毒的核酸。

5.3 實(shí)驗(yàn)室條件

在開展PCR或者RT-PCR的核酸檢測時，對實(shí)驗(yàn)室條件有一定要求：儀器設(shè)備方面，應(yīng)該配有PCR儀、熒光定量PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀等；操作區(qū)域分區(qū)：RNA提取區(qū)、RT-PCR配液區(qū)、基因擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)，不同區(qū)域要相互隔離；實(shí)驗(yàn)人員要接受過RT-PCR操作專業(yè)培訓(xùn)，掌握防止RNA降解、核酸（含擴(kuò)增產(chǎn)物）污染和EB污染的具體措施，熟悉試劑的檢驗(yàn)和結(jié)果的判斷方法。

5.4 操作程序

所有實(shí)驗(yàn)都應(yīng)設(shè)立陰性和陽性對照。在購買的成品檢測試劑盒中通常都包含陰性和陽性質(zhì)控品。在RNA提取時，常用磁珠法或柱模法。RNA擴(kuò)增體系的配制過程，人員進(jìn)入后要換工作服，保證環(huán)境的潔凈度。下一步，將模板加入到擴(kuò)增體系中，進(jìn)行PCR或熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過電泳或?qū)崟r熒光曲線分析進(jìn)行結(jié)果判定。

5.5 注意事項(xiàng)

RT-PCR檢測的試劑由專人負(fù)責(zé)整理、分裝、保存；避免實(shí)驗(yàn)人員或其他人員在實(shí)驗(yàn)臺面周圍走動；RNA提取時，須穿上工作服，帶上帽子和口罩，并勤換手套；避免說話，尤其是對著操作的物品或臺面說話，避免中斷操作接聽手機(jī)和電話等其他事務(wù)；手指不要接觸離心管口的內(nèi)壁，盡可能用鑷子替代手去取用東西。核酸提取步驟必須使用帶濾芯的吸頭；10UL以內(nèi)的使用長吸頭，且加樣時要輕，吸取與模板有關(guān)的液體時避免反復(fù)吹打；移液器與吸頭盒嚴(yán)格分開（核酸提取、反應(yīng)液配制、電泳加樣）；擴(kuò)增產(chǎn)物只是在電泳區(qū)域打開，禁止將電泳區(qū)的吸頭盒和移液器帶回上游實(shí)驗(yàn)室；實(shí)驗(yàn)室須消毒（10%次氯酸鈉消毒桌面、普通消毒水消毒地面和器皿；75%酒精棉球擦拭槍體），注意通風(fēng)。

6 禽流感病毒血清學(xué)檢測技術(shù)

血清學(xué)檢測包括血凝試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、免疫膠體金試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫組化試驗(yàn)。禽流感病毒檢測主要用血凝試驗(yàn)（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI），原理非常簡單。HA試驗(yàn)原理就是病毒表面的血凝素與多種動物的紅細(xì)胞表面受體結(jié)合，出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。Hl試驗(yàn)原理就是病毒的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可以被特異性免疫血清抑制，加入特異性免疫血清之后，病毒就不能與紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)。

在進(jìn)行Hl試驗(yàn)之前，要進(jìn)行4個血凝單位（HAU）抗原的配制。具體方法如下：首先根據(jù)血凝價去配制，假設(shè)效價是1：256，則4 HAU=256/4=64；取6.3 mL PBS，加入0.1 mL抗原，即將抗原1：64稀釋獲得4 HAU；之后是最重要的一步，即對4 HAU進(jìn)行驗(yàn)證。在2020版國標(biāo)里添加了對這部分內(nèi)容的詳細(xì)說明，首先將4HAU抗原進(jìn)行系列稀釋，使最終稀釋比例分別為1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7；然后取25UL稀釋的抗原+25μ L PBS+25μ L l%紅細(xì)胞，混勻反應(yīng)；如果配制的抗原為4 HAU，則1：4稀釋將出現(xiàn)凝集終點(diǎn)；如果高于4 HAU，可能1：5或1：6稀釋為終點(diǎn)；如果低于4HAU，可能1：2或1：3稀釋為終點(diǎn)。

HA與Hl試驗(yàn)有許多優(yōu)點(diǎn)，操作比較簡單，不需要精密的儀器，有些公司開發(fā)了專門的儀器來進(jìn)行結(jié)果判讀，被廣泛地應(yīng)用于禽流感病原鑒定和抗體檢測；缺點(diǎn)是用雞紅細(xì)胞檢測哺乳動物和水禽血清時，需除去血清中的非特異凝集素，再就是試驗(yàn)結(jié)果判定具有主觀性。

7 關(guān)于高致病性禽流感病毒綜合判定

一是疑似感染高致病性禽流感病毒?？筛鶕?jù)發(fā)病禽的臨床癥狀、剖檢變化等情況，初步判為高致病性禽流感臨床疑似病例，且H5或H7亞型的RT-PCR或?qū)崟r熒光RT-PCR檢測陽性，可判為高致病性禽流感疑似病例[3]。二是確診。病毒分離物經(jīng)HA和Hl試驗(yàn)確定為流感病毒，且分離物的IVPI值大于1.2，判定為高致病性禽流感病毒；如果IVPI值小于1.2的H5或H7亞型禽流感病毒，在HA裂解位點(diǎn)處具有與HPAI病毒相似的氨基酸序列，亦判定為高致病性禽流感病毒。分離到高致病性禽流感病毒的病例判定為高致病性禽流感確診病例。

8 做好高致病性禽流感的防控思考

一是2021年全球HPAI疫情流行嚴(yán)重，呈季節(jié)性暴發(fā)，流行范圍擴(kuò)大，形勢嚴(yán)峻，尤其是H5N1亞型有再次大流行的風(fēng)險(xiǎn)，需要密切關(guān)注全球疫情動態(tài)，加強(qiáng)疫情監(jiān)測，提高預(yù)警和應(yīng)急反應(yīng)能力[4]。二是秋冬季節(jié)氣溫較低，家禽抵抗力下降，病毒存活能力增強(qiáng)，且候鳥遷徙導(dǎo)致高致病性禽流感病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)加大，養(yǎng)殖場戶應(yīng)進(jìn)一步做好高致病性禽流感防控工作。三是要針對不同飼養(yǎng)周期的家禽，制定科學(xué)合理的免疫程序，確?；A(chǔ)免疫完善，及時補(bǔ)免。對于靠近野外環(huán)境的場區(qū)，要安裝防鳥網(wǎng)，防止野禽和家禽接觸。四是秋冬季節(jié)，室內(nèi)外溫差大，要保證禽舍的密閉性和保溫性，做好潮濕盒結(jié)塊墊料的清理工作。

參考文獻(xiàn)：

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[3] 劉建文，李月輝高致病性禽流感疫情動態(tài)及公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)分析[J]家禽科學(xué).2021（10）：20-22

[4]曹蕓，陳霞，戴玉嬌，等2021年全球高致病性禽流感疫情分析[J]中國動物榆疫.2022，39（6）：19-23