陳高翩 黃俊忠 徐萬幫 方 竑

[廣東省藥品檢驗所中成藥室/中藥材(飲片)室，廣東 廣州 510700]

中成藥成分復(fù)雜，單一成分難以體現(xiàn)中藥的優(yōu)勢，但是多成分的質(zhì)量分析要求的對照品也相應(yīng)增加，大部分對照品提取繁瑣且成本高，不利于質(zhì)量控制，故提出了一測多評(QAMS)法多成分質(zhì)量控制的思路[1]。該方法相比之前多成分的質(zhì)量分析，大大縮小了提取時間和降低了檢驗成本。因此，一測多評法相繼應(yīng)用于各個中藥的質(zhì)量控制[2-5]。

目前，白花油的質(zhì)量評價以薄荷腦、樟腦與水楊酸甲酯為主[6-8]，且這3種成分均為揮發(fā)性物質(zhì)，沸點較低，有關(guān)這些成分的測定多采用常規(guī)外標法單獨檢測組分的含量。本實驗將“一測多評”的方法首次應(yīng)用到和興白花油的質(zhì)量控制中，在不使用任何內(nèi)標物前提下，同步測定薄荷腦、樟腦、水楊酸甲酯、桉油精、芳樟醇5種有效活性成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 氣相色譜儀(型號：GC-2010 PLUS，日本島津公司)；氫氣發(fā)生器(型號：HG-1803A，北京科普生分析科技有限公司)；空氣發(fā)生器(型號：AG-1602，北京科普生分析科技有限公司)；色譜柱：HP-INNOWAX毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，安捷倫科技有限公司)，InertCap WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，日本GL Science)；電子分析天平(型號：CP225D，SARTORIUS公司，精度：萬分之一)。

1.2 試藥 和興白花油(生產(chǎn)批號：PGEBH062、PGEBH046、PGEBH015、PGEBH011、PGEBH031、PGEBH001、PDKBG023、PDKBG025、PDKBG033、PGEBG066、PGEBG083、PGEBG095、PGEBG081、PGEBG093、PGEBG101、PGEBG080、PGEBG122、PGEBG132，規(guī)格：每瓶裝20 mL、每瓶裝10 mL、每瓶裝5 mL、每瓶裝2.5 mL，香港和興白花油藥廠有限公司提供)；桉油精對照品(批號：110788-201105，含量99.9%，購自中國食品藥品檢定研究院)；樟腦對照品(批號：110747-201409，含量98.7%，購自中國食品藥品檢定研究院)；芳樟醇對照品(批號：111503-201302，含量98.5%，購自中國食品藥品檢定研究院)；乙酸芳樟醇對照品(批號：A14420，含量96.9%，香港和興白花油藥廠有限公司提供)；薄荷腦對照品(批號：110728-200506，含量100.0%，購自中國食品藥品檢定研究院)；水楊酸甲酯對照品(批號：110707-201413，含量99.7%，購自中國食品藥品檢定研究院)；無水乙醇為分析純(批號：20171001-2，含量99.7%，購自廣州化學(xué)試劑廠)；乙酸乙酯為分析純(批號：20171203-2，含量99.5%，購自廣州化學(xué)試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測多評方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱為HP-INNOWAX毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；柱溫為程序升溫，起始溫度為80 ℃，以10 ℃/min升溫至180 ℃，保持3 min；檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID)，溫度為220 ℃，進樣口溫度為200 ℃，載氣為氮氣，進樣量為1 μL；分流比60∶1；理論板數(shù)按薄荷腦峰計算應(yīng)不低于60 000，2個相鄰色譜峰的分離度R>1.5。對照品及樣品GC圖譜見圖1。

注：A為混合對照品，B為樣品；1.桉油精；2.樟腦；3.芳樟醇；4.薄荷腦；5.水楊酸甲酯圖1 對照品及樣品GC圖譜

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 混合對照品儲備液的制備 精密稱取薄荷腦對照品3.032 4 g、樟腦對照品0.618 6 g、水楊酸甲酯對照品4.002 3 g、桉油精對照品1.801 9 g、芳樟醇對照品0.301 2 g，同置于100 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，制得混合對照品儲備液。

2.1.2.2 供試品的制備 精密量取和興白花油1 mL，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻即得。

2.1.2.3 陰性對照溶液的制備 按照和興白花油的處方比例和制備方法，分別制備缺少桉油精、樟腦、芳樟醇、薄荷腦以及水楊酸甲酯的陰性對照樣品，再按“2.1.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.1.3 線性范圍考察 分別精密吸取“2.1.2.1”項下的薄荷腦、樟腦、水楊酸甲酯、桉油精及芳樟醇混合對照品儲備液0.25、0.5、1、2、3、5、6 mL置于7個不同的10 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，制成一系列濃度的薄荷腦、樟腦、水楊酸甲酯、桉油精、芳樟醇混合標準溶液。精密吸取1 μL上述混合對照品溶液，分別進樣分析測定各成分的峰面積，以濃度對峰面積積分值進行回歸處理，得各成分的回歸方程和線性范圍。結(jié)果見表1。

表1 5種成分回歸方程和線性范圍

2.1.4 待測成分相對校正因子計算 依“2.1.3”項下各梯度濃度的對照品母液求得的結(jié)果(見表1～表4)，以薄荷腦作為內(nèi)參物，計算薄荷腦對樟腦、桉油精、水楊酸甲酯、芳樟醇的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表2 4個待測成分與薄荷腦的相對校正因子

2.1.5 精密度試驗 精密量取“3.1.2.1”項下混合對照品5 mL，加無水乙醇定容置25 mL容量瓶，搖勻即得。精密吸取1 μL注入氣相色譜儀，記錄各待測成分(桉油精、樟腦、芳樟醇、薄荷腦、水楊酸甲酯)的峰面積，重復(fù)測定6次，進行日內(nèi)精密度試驗；每天2次，進行日間精密度試驗。日內(nèi)精密度試驗結(jié)果，上述各待測成分的峰面積的RSD分別為0.35%、0.41%、0.38%、0.45%、0.41%；日間精密度試驗結(jié)果，上述各待測成分的峰面積的RSD分別為0.53%、0.46%、0.57%、0.51%、0.62%。結(jié)果表明儀器精密度良好，符合定量分析的要求。

2.1.6 重復(fù)性試驗 精密移取供試品(批號：PGEBH062)6份，按“2.1.2.2”項下供試品制備，分別精密吸取1 μL進樣測定，計算桉油精、樟腦、芳樟醇、薄荷腦、水楊酸甲酯5種成分的平均含量及其RSD。結(jié)果平均含量分別為156.82、287.49、57.38、390.27和22.99 mg·mL-1，RSD分別為0.17%、0.16%、0.19%、0.21%、0.22%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密移取“2.1.2.2”項下批號為PGEBH062的供試品溶液，在0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、48 h后，依法測定樣品中各待測成分峰面積積分值，薄荷腦、樟腦、桉油精、水楊酸甲酯、芳樟醇RSD分別為0.71%、0.86%、0.92%、1.16%、1.30%。結(jié)果表明供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加標回收率 精密稱取薄荷腦對照品1.442 7 g、樟腦對照品0.283 3 g、水楊酸甲酯對照品1.960 3 g、桉油精對照品0.803 5 g、芳樟醇對照品0.110 7 g，置于同一10 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，制得混合對照品①，分別含薄荷腦、樟腦、水楊酸甲酯、桉油精、芳樟醇80.189 3 mg·mL-1、27.253 46 mg·mL-1、194.853 82 mg·mL-1、80.189 3 mg·mL-1、10.903 95 mg·mL-1。

取已知含量的和興白花油(批號：PGEBH031)，精密量取0.5 mL，平行做6份，分別精密加入混合對照品①0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，依“2.1.2.2”項下制得供試品，按“2.1.1”色譜條件測定。平均回收率結(jié)果在95%～105%，RSD<3%,說明本法回收率結(jié)果可行。見表3。

表3 5種成分回收加標率 (%)

2.2 相對校正因子(RCF)耐用性考察

2.2.1 不同色譜柱耐用性考察 在同一色譜條件

下，分別用色譜柱1即廠牌為HP-INNOWAX序號為USD727711H(30 m×0.25 mm×0.25 um)和色譜柱2即廠牌為InertCap WAX序號為U1204i24(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱，取“2.2.2.1”項下混合儲備液，精密移取5 mL,置25 mL容量瓶中，無水乙醇定容，各進樣1 μL，測定。結(jié)果顯示色譜柱1和色譜柱2所測得的內(nèi)參物(薄荷腦)與其他組分(樟腦、水楊酸甲酯、桉油精、芳樟醇)之間的RCF的RSD分別為2.53、2.30、2.38、2.22，均小于5%，說明不同色譜柱條件下所測得的薄荷腦與其他待測組分的RCF耐用性較好。

2.2.2 不同儀器耐用性考察 在同一色譜條件下，分別用儀器1即廠牌為SHIMADZU型號為GC-2014編號為C1295氣相色譜儀和儀器2即廠牌為SHIMADZU型號為GC-2010AF編號為C1743氣相色譜儀，取“2.2.2.1”項下混合儲備液，精密移取5 ml,置于25 ml容量瓶中，無水乙醇定容，各進樣1 μL測定。結(jié)果顯示儀器1和儀器2所測得的其他待測成分(樟腦、水楊酸甲酯、桉油精、芳樟醇)與薄荷腦之間的RCF的RSD分別為1.67%、2.33%、2.94%、2.12%，均小于5%，表明在不同儀器條件下所測得的薄荷腦與樟腦、水楊酸甲酯、桉油精及芳樟醇的RCF耐用性較好。

2.3 目標色譜峰的定位 針對在只使用單個對照品時， 如何正確定位和興白花油中其余 4 個目標色譜峰的問題。本文分別引入采用各待測成分間的保留時間差、 分離度和相對保留值(待測成分與內(nèi)標調(diào)整保留時間之比) 3 種參數(shù)作為定位標準，并在 2 種不同型號氣相色譜系統(tǒng)和 2 根不同品牌的同類填料色譜柱下對這 3 個參數(shù)進行考察，比較結(jié)果顯示，采用各待測成分間的相對保留值更能夠準確定位上述目標色譜峰。

2.4 樣品的測定 精密吸取1 μL“2.1.2.2”項下供試品溶液，注入氣相色譜儀中，采用QAMS法和外標法依法(ESM)計算6批和興白花油樣品的含量，來驗證QAMS法用于和興白花油多指標質(zhì)量評價的準確性，結(jié)果(見表4)顯示，采用QAMS法及ESM測得的和興白花油中桉油精、樟腦、芳樟醇、薄荷腦、水楊酸甲酯的含量值無顯著性差異，RSD<3%，說明QAMS法的可信度較高，在和興白花油的多成分質(zhì)量評價中應(yīng)用是可行的。

表4 桉油精、樟腦、芳樟醇、薄荷腦及水楊酸甲酯含量樣品測定結(jié)果

3 結(jié)果與討論

3.1 內(nèi)參物的選擇 實驗選用薄荷腦作為內(nèi)參物建立與和興白花油其他有效成分間的RCF原因是：薄荷腦為和興白花油的主要有效成分，對照品較其他成分相對廉價易得，含量也較高。

3.2 目標色譜峰的定位 在本實驗的色譜條件下，由于和興白花油色譜圖中色譜峰圖譜相對比較復(fù)雜，QAMS法待測組分色譜峰的定位方式有2類：其一是相對保留時間差值(△RT)或是相對保留比值來進行定位；其二適用于色譜柱之間誤差大的情況，利用不同色譜柱下各組分與保留時間存在線性，推出回歸方程，進行定位，但該方法應(yīng)用少，還需進一步的研究。本實驗中就是通過桉油精、芳樟醇、樟腦、薄荷腦、水楊酸甲酯之間的相對保留時間差進行定位，結(jié)果顯示其RSD均遠低于3%。這種定位方式使用于和興白花油，在測定桉油精、芳樟醇、樟腦、薄荷腦、水楊酸甲酯5種成分的含量時，只需有薄荷腦對照品，即可通過QAMS法實現(xiàn)5種成分含量的同步含量測定。

該方法以薄荷腦成分為內(nèi)參物，建立該成分與樟腦、水楊酸甲酯、桉油精、芳樟醇的相對校正因子，并計算這4種成分相對應(yīng)的含量，與ESM測定白花油中5種成分的含量無顯著性差異(RSD%<3%)，通過QAMS技術(shù)實現(xiàn)同步測定白花油中多指標成分，為白花油多指標質(zhì)量控制模式提供新方法。