吳春成 連雅晨 鄧世山 楊洪斌

1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學院解剖教研室，四川南充 637000

鼻咽癌是臨床常見惡性腫瘤，具有明顯的地域性。據統(tǒng)計，約70%的鼻咽癌病例發(fā)生在東亞及東南亞[1]。在現有診療模式下，鼻咽癌患者的5 年生存率大大提高，但鼻咽癌的遠處轉移及復發(fā)仍是制約鼻咽癌患者總體生存率的一個重要因素[2]。因此，尋找新的鼻咽癌分子標志及治療靶點是當前研究熱點。微管蛋白是腫瘤治療的重要靶點，微管蛋白聚合并經修飾后形成微管，構成細胞骨架[3]。研究表明微管蛋白酪氨酸連接酶類似物12（tubulin tyrosine ligase like 12，TTLL12）可通過干擾硝基化酪氨酸與微管的連接，減少硝基化酪氨酸微管蛋白（N-tubulin）形成，干擾人體清除異常細胞，從而促進腫瘤細胞生長[4]。有學者發(fā)現TTLL12 在肺癌、結直腸癌、前列腺癌和卵巢癌中表達明顯升高，并與患者的不良預后密切相關[5-8]。本研究利用免疫組織化學法及鼻咽癌基因芯片數據分析，探討TTLL12 在鼻咽癌組織中的臨床意義及可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科2016 年1 月至2019 年12 月初治鼻咽癌患者的組織石蠟標本84 例和慢性鼻咽炎患者的組織石蠟標本28 例。所有患者均于我院喉鏡下取活檢，有完整的石蠟標本；鼻咽癌患者在取組織標本前均未接受任何有關鼻咽癌的治療，并住院完成全部常規(guī)標準治療，且臨床病歷資料完整。所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法及結果判定

將石蠟標本按照免疫組織化學Super Vision二步法檢測組織中TTLL12 的表達。采用染色強度與陽性細胞百分比的乘積進行半定量分析染色結果。染色強度計分：無著色計0 分，著淺棕色計1 分，著棕色計2 分，著深棕色計3 分；陽性細胞百分比計分：≤5%計0 分，6%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，＞75%計4 分；總分為染色強度與陽性細胞百分比的乘積：0～1 分為陰性，2～4 分為+，5～8 分為++，9～12 分為+++，并定義≤4 分為低表達，＞4 分為高表達。

1.3 基因芯片數據分析

從GEO（Gene Expression Omnibus）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中篩選合適的基因芯片數據集GSE102349。GSE102349 中包含113例未分化鼻咽癌樣本。使用R 4.1.1 軟件繪制箱式圖，分析不同臨床分期中TTLL12 基因在轉錄水平上的表達差異。Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，分析TTLL12 與鼻咽癌患者無進展生存的相關性。

1.4 基因富集分析

對GSE102349 芯片行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，使用R 4.1.1 軟件篩選差異基因。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0 軟件對實驗數據進行統(tǒng)計學分析，計數資料采用例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，多因素分析用Cox 回歸模型分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TTLL12 在鼻咽癌組織中的表達

TTLL12 主要定位于細胞質，細胞質含棕色或深棕色顆粒定義為高表達，見圖1、圖2。鼻咽癌組織TTLL12 高表達57 例，低表達27 例；鼻咽慢性炎癥組織TTLL12 高表達3 例，低表達25 例。與鼻咽慢性炎癥組織相比，TTLL12 蛋白在鼻咽癌組織中的表達顯著上調（P＜0.001）。

圖1 TTLL12 在鼻咽慢性炎癥組織中低表達，細胞排列規(guī)則有序，細胞質無著色或著淺黃色（SP×400）

圖2 TTLL12 在鼻咽癌組織中高表達，細胞排列紊亂、異形、大小不一，細胞質呈棕色或深棕色（SP×400）

2.2 鼻咽癌患者不同臨床病理特征與TTLL12表達的關系

TTLL12 高表達鼻咽癌患者的T3～T4、N2～N3、Ⅲ～Ⅳ期的占比顯著高于 TTLL12 低表達患者（P＜0.05），但TTLL12 表達在不同年齡、性別、M分期的鼻咽癌患者中比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 鼻咽癌患者不同臨床病理特征與TTLL12 表達的關系（例）

2.3 TTLL12 表達與鼻咽癌患者預后的關系

截至隨訪終點，鼻咽癌患者死亡18 例，其中高表達組16 例，低表達組2 例，高表達組患者的總生存顯著低于低表達組（P=0.027），見圖3。進一步行Cox 回歸模型分析發(fā)現，TTLL12 高表達和N 分期均是影響鼻咽癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），見表2。

表2 Cox 回歸模型分析影響鼻咽癌患者的預后因素

圖3 鼻咽癌患者Kaplan-Meier 生存曲線

2.4 TTLL12 在基因芯片數據集中的表達情況

在基因芯片數據集 GSE102349 中，TTLL12 mRNA 的表達水平與臨床分期呈正相關，分期越晚，TTLL12 mRNA 的表達越高（P=0.033），見圖4；TTLL12 高表達的鼻咽癌患者無進展生存率顯著低于TTLL12 低表達患者（P=0.041），見圖5。

圖4 不同臨床分期的鼻咽癌患者的TTLL12 mRNA 表達差異散點圖

圖5 不同TTLL12表達水平鼻咽癌患者的無進展生存曲線

2.5 功能基因富集分析

KEGG 富集分析結果提示，TTLL12 高表達基因樣本主要富集在趨化因子信號通路，與人類T 細胞白血病病毒1 型感染及EB 病毒感染密切相關，見圖6。

圖6 KEGG 富集分析

3 討論

微管活動異?？赡芤鹑旧w功能和結構的錯誤，從而導致染色體不穩(wěn)定[9]。研究表明，染色體不穩(wěn)定可導致細胞內變異，促進細胞表型向惡性特征轉變[10]。TTLL 家族為微管蛋白相關蛋白，可調節(jié)微管蛋白或微管活性[11]。研究發(fā)現TTLL 家族與腫瘤異常表達和癌癥進展密切相關[12]。

本研究中，利用免疫組織化學分析TTLL12 的表達情況，證實TTLL12 在鼻咽癌組織中表達上調，提示TTLL12 可通過某種細胞代謝途徑參與促進鼻咽癌發(fā)病過程。研究發(fā)現TTLL12 表達越高的患者T、N 及臨床分期越晚，且Cox 回歸模型顯示TTLL12 高表達和N分期均是影響鼻咽癌患者總生存的獨立危險因素。提示TTLL12 作為潛在的原癌基因，參與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展，表明 TTLL12可作為一個潛在的基因靶點用于鼻咽癌患者預后預測及治療。

本研究利用GEO 數據庫中的數據集，分析TTLL12 在不同鼻咽癌患者中的mRNA 水平表達差異，結果顯示TTLL12 在臨床分期越晚的鼻咽癌患者中表達越高，與本研究結果相符。TTLL12 表達水平與鼻咽癌患者無進展生存明顯相關。KEGG 富集分析結果顯示TTLL12 基因主要富集在趨化因子信號通路，與人類T 細胞白血病病毒1 型感染及EB病毒感染密切相關。趨化因子信號可導致靶基因轉錄，參與細胞的侵襲、運動、與細胞外基質的相互作用。人類癌癥有一個復雜的趨化因子網絡，影響腫瘤浸潤的程度和表型及腫瘤的生長、生存、侵襲和腫瘤內血管生成[13]。由此猜測，TTLL12 基因在鼻咽癌患者中可能通過促進趨化因子的表達，從而促進鼻咽癌生長及轉移。腫瘤可在病毒感染后發(fā)生發(fā)展，病毒感染除引起慢性炎癥外，還可通過炎癥相關機制抑制抑癌基因，避免感染細胞凋亡，從而有利于病毒的潛伏、宿主細胞的增殖和持續(xù)感染[14]。越來越多的證據表明人類T 細胞白血病病毒1 型和EB 病毒的持續(xù)感染與成人T 細胞白血病和鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[15]。TTLL12 可能是這些病毒激活的一種促癌產物，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上，TTLL12 在鼻咽癌中是一個重要的原癌基因，其蛋白表達上調在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且是影響鼻咽癌患者預后的獨立危險因素。