宋發(fā)萍，張潔，唐勇，劉宗梅，王曉玲（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 7000；.安康市中醫(yī)醫(yī)院腦病科，陜西 安康 75000）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）約占卒中總?cè)藬?shù)的80%，是世界第二大死亡原因和第三大致殘?jiān)騕1]。時(shí)間窗內(nèi)靜脈溶栓和動(dòng)脈取栓是IS急性期的有效治療手段[2]。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI）是IS預(yù)后不良的重要因素。細(xì)胞凋亡在CIRI病理進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，受p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3等基因的調(diào)控，已有研究證實(shí)抑制細(xì)胞凋亡可減輕CIRI，保護(hù)神經(jīng)功能[3]。

平肝活血散是陜西省名中醫(yī)王曉玲教授治療卒中的經(jīng)驗(yàn)方，由天麻15 g、赤芍12 g、三七6 g、益母草15 g、竹茹10 g組成，具有平肝熄風(fēng)、活血化瘀、清熱化痰之功。前期研究證實(shí)，該方能促進(jìn)腦出血患者腦水腫消退，改善超敏C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子表達(dá)[4-5]。方中主藥在CIRI中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可有效抑制神經(jīng)元凋亡[6-7]，但其作用機(jī)制尚不明確。為此本研究考察了平肝活血散對(duì)大鼠CIRI的影響，初探其作用機(jī)制，旨在為明確平肝活血散治療CIRI的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括TB-718EL型組織包埋機(jī)（湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司）、Nikon Eclipse E100型顯微鏡（日本Nikon公司）、RT-6100型酶標(biāo)儀（美國(guó)Rayto公司）、D3024R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司]、Mini-PROTEAN Tetra型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、Odyssey型雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國(guó)Li-Cor公司）等。

1.2 藥品與試劑

平肝活血散配方顆粒劑（批號(hào)分別為0052263、0060273、0041413、8111413、0095043，劑量與平肝活血散劑量等效）購(gòu)自廣東一方制藥有限公司；通心絡(luò)膠囊（批號(hào)219980015，規(guī)格0.26 g/粒）購(gòu)自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司；4%多聚甲醛溶液（批號(hào)AR1068）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）試劑（批號(hào)DY30104-10g）購(gòu)自上海迪醫(yī)明生物科技有限公司；尼氏染液（批號(hào)G1036）、TUNEL試劑盒（批號(hào)G1507）、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)G2026）、聚偏二氟乙烯膜（批號(hào)G6015）均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；小鼠β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)8227）、兔抗抑癌p53單克隆抗體（批號(hào)33889）、兔抗B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體（批號(hào)196495）、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）多克隆抗體（批號(hào)32503）、兔抗胱天蛋白酶3（Caspase-3）單克隆抗體（批號(hào)184787）、兔抗活化Caspase-3（Cleaved Caspase-3）多克隆抗體（批號(hào)32042）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠免疫球蛋白G二抗（批號(hào)分別為ZB-2306、ASP-9100）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動(dòng)物

80只SD雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（川）2020-030。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批，批準(zhǔn)號(hào)為SUCMDL20210907001。

2 方法

2.1 造模

大鼠造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]，采用線栓法造模，具體操作如下：大鼠麻醉后固定于木板上，沿頸部正中作2 cm左右縱行切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈；使用手術(shù)線結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，另在頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈（兩者分叉部位上約2 mm處）用手術(shù)線各打一活結(jié)，在頸總動(dòng)脈靠近分叉前1 cm作一“V”切口，線栓進(jìn)入方向?yàn)轭i總動(dòng)脈→頸內(nèi)動(dòng)脈，進(jìn)線栓長(zhǎng)度17～18 mm，感覺(jué)線栓有輕微阻力時(shí)停止推進(jìn)，此時(shí)線栓前端到達(dá)大鼠大腦中動(dòng)脈起始處，立即夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈防止線栓脫落；1 h后拔出線栓，觀察大鼠眼球顏色，以白色變?yōu)榧t色，表示CIRI模型造模完成。大鼠造模清醒后，依照Longa評(píng)分法對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分：0分表示無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀，1分表示左前爪或后肢無(wú)法完全伸展，2分表示行走時(shí)左轉(zhuǎn)或追尾，3分表示爬行時(shí)向左傾倒，4分表示意識(shí)喪失或不能自主行走[9]；1～3分表明CIRI模型造模成功，評(píng)分為0或4分的大鼠被剔除。假手術(shù)組大鼠僅分離血管不插線栓。

2.2 分組與給藥

80只大鼠選取12只作為假手術(shù)組，剩余大鼠按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行造模，結(jié)果有60只大鼠造模成功，成功率為88%。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（通心絡(luò)膠囊0.325 g/kg，根據(jù)成人與大鼠等效劑量系數(shù)換算臨床等效劑量）和平肝活血散低、中、高劑量組（3.02、6.04、12.08 g/kg，按臨床等效劑量的 50%、100%、200%設(shè)置），每組12只。假手術(shù)組及模型組大鼠灌胃等體積水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)劑量藥液（以水為溶劑制備的混懸液），每日1次，連續(xù)14 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 神經(jīng)功能評(píng)分 觀察各組9只大鼠干預(yù)第1、7、14天的Longa評(píng)分。

2.3.2 腦梗死體積 采用TTC法測(cè)定。干預(yù)14 d后，從每組取3只大鼠，麻醉處死后取腦組織，沿冠狀面切片，厚約2 mm，于2%TTC試劑中37 ℃避光染色30 min，再于4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液中固定2 h，拍照后用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，記錄大鼠腦梗死體積（染為灰白色）及全腦體積（染為紅色），計(jì)算腦梗死體積百分比=（腦梗死面積×厚度）/（全腦面積×厚度）×100%。

2.3.3 神經(jīng)元損傷 采用尼氏染色。干預(yù)14 d后，從每組取4只大鼠，麻醉處死后取腦組織，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，行脫水包埋，切片，梯度乙醇水化，甲苯胺藍(lán)染液染色后冰醋酸分化，二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封固，置于顯微鏡下觀察，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析神經(jīng)元密度（模型組大鼠在取材時(shí)死亡1只）。

2.3.4 神經(jīng)元凋亡 采用TUNEL染色。每組取“2.3.3”項(xiàng)下4只已處死大鼠的腦組織切片，脫蠟，用梯度乙醇水化，蛋白酶K工作液修復(fù)，破膜后加buffer室溫平衡，加反應(yīng)液，4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，封片，置于顯微鏡下觀察（凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核為綠色熒光，正常細(xì)胞核為藍(lán)色熒光）。

2.3.5 腦缺血皮層中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 采用Western blot法檢測(cè)。干預(yù)14 d后，從每組取3只大鼠，麻醉后予生理鹽水心臟灌流，冰上取腦。右腦組織裂解，提取總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白定量，添加1/5體積的5×上樣緩沖液，蛋白煮沸變性，電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，室溫封閉1 h，加入p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃搖床過(guò)夜；用1×TBST緩沖液清洗3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1∶10 000），室溫避光孵育2 h，用1×TBST緩沖液清洗3次。運(yùn)用Odyssey型雙色紅外熒光成像系統(tǒng)成像、拍照。借助Image J軟件計(jì)算目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)參（β-actin）灰度值的比值，以此作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，方差齊性時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，并采用LSD法進(jìn)行兩兩比較；方差不齊時(shí)，多組間比較采用Tamhane’sT2檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布且方差不齊的數(shù)據(jù)，以M（P25，P75）表示，并采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。Longa評(píng)分使用兩因素重復(fù)測(cè)量資料的方差分析進(jìn)行組間比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠干預(yù)第1、7、14天的Longa評(píng)分均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠干預(yù)第7和14天的Longa評(píng)分均顯著降低（P＜0.05）。與同組干預(yù)第1天比較，陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠第14天的Longa評(píng)分均顯著降低（P＜0.01）。與同組干預(yù)第7天比較，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散低、高劑量組大鼠第14天的Longa評(píng)分均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠的Longa評(píng)分比較（±s，n＝9，分）

表1 各組大鼠的Longa評(píng)分比較（±s，n＝9，分）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與同組第1天比較，P＜0.01；d：與同組第7天比較，P＜0.05；e：與同組第7天比較，P＜0.01

第14天0 2.22±0.67ad 1.33±0.50bce 1.78±0.44e 1.56±0.53bc 1.67±0.50bcd組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組平肝活血散低劑量組平肝活血散中劑量組平肝活血散高劑量組第1天0 2.33±0.71a 2.22±0.44 2.11±0.78 2.33±0.50 2.33±0.50第7天0 2.67±0.50a 2.00±0.50b 2.44±0.53 1.89±0.60b 2.11±0.60b

3.2 大鼠腦梗死情況

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠右腦呈現(xiàn)明顯的灰白色梗死區(qū)，其腦梗死體積百分比顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦梗死體積百分比均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦組織TTC結(jié)果

表2 各組大鼠腦梗死體積百分比和神經(jīng)元密度測(cè)定結(jié)果

3.3 大鼠神經(jīng)元損傷情況

假手術(shù)組大鼠腦缺血皮層細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，著色均勻，尼氏小體染色規(guī)則。模型組大鼠腦缺血皮層細(xì)胞紊亂，形態(tài)不規(guī)則，尼氏小體缺失形成空泡。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠尼氏小體數(shù)量明顯減少。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層神經(jīng)元損傷均有不同程度減輕，尼氏小體數(shù)量明顯增加。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠神經(jīng)元損傷染色圖（尼氏染色，×400）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血皮層神經(jīng)元密度顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層神經(jīng)元密度均顯著增加（P＜0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，平肝活血散低劑量組大鼠腦缺血皮層神經(jīng)元密度顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.4 大鼠神經(jīng)元凋亡情況

假手術(shù)組大鼠腦缺血皮層未見(jiàn)凋亡細(xì)胞，模型組、平肝活血散低劑量組大鼠腦缺血皮層可見(jiàn)大量細(xì)胞凋亡。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層凋亡細(xì)胞數(shù)量均有不同程度減少。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠神經(jīng)元凋亡情況（TUNEL染色，×400）

3.5 大鼠腦缺血皮層中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血皮層中p53、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層中p53、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散高劑量大鼠腦缺血皮層中Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，平肝活血散低劑量組大鼠腦缺血皮層中上述蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），平肝活血散高劑量組大鼠腦缺血皮層中Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖4、表3。

圖4 各組大鼠腦缺血皮層中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 各組大鼠腦皮缺血層中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況（±s，n＝3）

表3 各組大鼠腦皮缺血層中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況（±s，n＝3）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.01；b：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01；d：與模型組比較，P＜0.05；e：與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P＜0.05；f：與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P＜0.01

Cleaved Caspase-3 0.12±0.06 0.36±0.08a 0.20±0.05d 0.36±0.05f 0.24±0.03d 0.05±0.02ce組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組平肝活血散低劑量組平肝活血散中劑量組平肝活血散高劑量組p53 0.29±0.07 0.55±0.09a 0.28±0.08c 0.47±0.09e 0.36±0.08d 0.29±0.09c Bcl-2 0.89±0.14 0.50±0.09b 0.86±0.17d 0.51±0.10e 0.61±0.12 0.85±0.15d Bax 0.13±0.05 0.45±0.16a 0.20±0.08c 0.40±0.11e 0.21±0.04c 0.12±0.03c Caspase-3 0.17±0.02 0.39±0.02a 0.28±0.03c 0.40±0.03f 0.28±0.02c 0.16±0.02cf

4 討論

CIRI指腦梗死區(qū)域恢復(fù)血流后引發(fā)更為嚴(yán)重?fù)p害的病理生理現(xiàn)象[10]。通心絡(luò)膠囊是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制而成的中藥復(fù)方制劑，具有益氣活血化瘀、祛風(fēng)通絡(luò)止痛的功效，臨床上常用于治療心腦血管病[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，通心絡(luò)膠囊可降低CIRI大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分及腦梗死體積，且抗凋亡作用明確，因此本研究將其作為陽(yáng)性對(duì)照藥物[12-13]。CIRI的主要病理改變?yōu)樯窠?jīng)元破壞、變性，腦梗死范圍的大小、肢體活動(dòng)障礙亦可很大程度反映其嚴(yán)重程度[14-15]。本研究的尼氏染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層細(xì)胞紊亂、尼氏小體缺損、空泡情況均改善，且神經(jīng)元密度顯著增加。同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠的Longa評(píng)分、腦梗死體積百分比均較模型組顯著降低。這提示中、高劑量的平肝活血散可減輕大鼠CIRI，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是由多重調(diào)節(jié)基因共同參與完成的一系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，為腦缺血再灌注后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的主要原因[16]。p53是細(xì)胞凋亡連鎖反應(yīng)的第一關(guān)鍵因素，可調(diào)控多種細(xì)胞凋亡和蛋白轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，腦缺血缺氧可激活p53表達(dá)增多，隨之調(diào)控下游的Bax和Bcl-2蛋白[17]；Bcl-2、Bax是Bcl-2家族調(diào)節(jié)和執(zhí)行內(nèi)部細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有所表達(dá)，Bcl-2是最重要的抗細(xì)胞凋亡因子，與Bax作用互相拮抗，可通過(guò)介導(dǎo)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑來(lái)抑制缺血所致的神經(jīng)元凋亡[18]。Bax是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的最強(qiáng)決定因素，在凋亡信號(hào)的刺激下，Bax移動(dòng)并插入線粒體外膜形成Bax大通道，致使線粒體外膜完整性被破壞，加速凋亡進(jìn)程[19]。Caspase-3為凋亡執(zhí)行蛋白，正常情況下，以無(wú)活性酶原的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，其活性形式（Cleaved Caspase-3）的表達(dá)是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[20]。Caspase-3的激活主要依賴(lài)于線粒體外膜上細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素C通過(guò)半胱氨酸蛋白激酶作用或與凋亡酶激活因子1結(jié)合致使胞漿內(nèi)多種重要的蛋白質(zhì)被裂解失活，進(jìn)而細(xì)胞核固縮、薄膜發(fā)泡、凋亡小體形成，最終發(fā)生凋亡[21]。本研究的TUNEL染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血皮層可見(jiàn)大量細(xì)胞凋亡；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血皮層中 p53、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，這提示p53、Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白參與了神經(jīng)元凋亡。有研究證實(shí)，藥物控制或基因干預(yù)使p53、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，可抑制神經(jīng)元凋亡，減輕CIRI，發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用[3，22]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散中、高劑量組大鼠腦缺血皮層中p53、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著降低，陽(yáng)性對(duì)照組和平肝活血散高劑量組大鼠腦缺血皮層中Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著升高。這提示中、高劑量的平肝活血散可下調(diào)p53、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制腦皮層細(xì)胞凋亡。

綜上所述，平肝活血散可保護(hù)CIRI模型大鼠腦神經(jīng)，抑制細(xì)胞凋亡；其機(jī)制可能與下調(diào)p53、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。