曾文俊，呂彩夢，丁建寶，李艷萍，馬建龍，楊 銳，楊 晉,4*

(1.北方民族大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.國家民委化工技術(shù)基礎(chǔ)重點實驗室，寧夏 銀川 750021；3.寧夏五行科技有限公司,寧夏 銀川 750001；4.寧夏天然藥物工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021；5.寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)自由基是引起基因突變的活性小分子原子基團，也是引起機體氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)的主要因素。正常情況下，人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除是一個動態(tài)的平衡，當(dāng)平衡被破壞，自由基在體內(nèi)累積過多時，會損傷蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)過氧體等生物分子，引發(fā)各種疾病，如動脈粥樣硬化[1-2]、心血管疾病[3]、糖尿病[4-5]、腫瘤[6-7]、癌癥[8]等。一般認(rèn)為，自由基氧化反應(yīng)是包含自由基的產(chǎn)生、傳遞及終止等多個步驟的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)式如下：

R·+O2→ROO·

自由基的傳遞：RH+ROO·→ROOH+R·

ROOH→RO·+·OH

R·+R·→R-R

自由基的終止：R·+ROO·→ROOR

ROO·+ROO·→ROOR+O2

研究表明，抗氧化劑可以通過抑制自由基生成或阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實現(xiàn)抗氧化作用。抗氧化劑的研究思路[9]一般是通過抗氧化活性評價篩選出有益人體健康的化合物，體外抗氧化實驗不僅沒有以動物為模型的體內(nèi)抗氧化實驗存在的生命倫理等諸多問題，而且能較為準(zhǔn)確地反映抗氧化劑的抗氧化能力，可幫助研究人員篩選出合適的抗氧化劑，是目前普遍使用的方法。目前，體外抗氧化活性評價方法主要有化學(xué)分析法和細胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity，CAA)法，不同評價方法的實驗原理、適用范圍各不相同，所得結(jié)果也有差異。作者在此對常用的體外抗氧化活性評價方法的反應(yīng)機理研究進展進行綜述，為準(zhǔn)確評價抗氧化活性提供參考。

在先進的節(jié)水灌溉技術(shù)推廣應(yīng)用過程中，如果缺少廣大農(nóng)牧民群眾參與，只有政府部門一方面開展，很難取得突出成效。因此在日常工作中，就需要做好農(nóng)田水利節(jié)水灌溉技術(shù)的廣泛宣傳工作，在全社會上下形成節(jié)水的好習(xí)慣、好風(fēng)氣。在實際工作過程中，可以通過對農(nóng)業(yè)用水價格進行調(diào)整，制定完善的鼓勵機制，促建社會大眾更加重視水資源，科學(xué)利用，從而有效促使先進的節(jié)水灌溉技術(shù)在廣大基層地區(qū)得到切實推廣應(yīng)用。通過開展廣泛的宣傳教育，對促進節(jié)水灌溉技術(shù)的快速推廣應(yīng)用，有著事半功倍的作用。

1 化學(xué)分析法

根據(jù)抗氧化方式，可以將化學(xué)分析法分為還原能力測定、自由基清除能力測定、溯源抑制作用測定等。

1.1 還原能力測定

抗氧化劑可以通過提供電子的形式清除自由基，因此抗氧化活性可用還原能力表示，即以相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的還原能力的量表示。還原能力越強，抗氧化活性就越高。

還原能力測定，是利用抗氧化劑的還原性將高價金屬離子還原成低價金屬離子，在相應(yīng)顯色劑作用下表現(xiàn)出光學(xué)差異，以此反映還原能力。根據(jù)金屬離子的不同，還原能力測定可以分為鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)測定、銅離子還原能力(cupric reducing antioxidant capacity，CUPRAC)測定[10-11]和普魯士藍法[12-13]，最常用的是FRAP法。FRAP法最早被用于測定血漿的還原能力[14]，后被廣泛用于天然植物抗氧化劑的還原能力測定[15-18]，作為評價抗氧化活性的標(biāo)準(zhǔn)之一。此外，用于測定總酚含量的福林酚法[19]也被用于測定還原能力，所以抗氧化劑的還原能力與多酚含量呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)較高[20-21]。

用還原能力評價抗氧化活性只能說明抗氧化劑具有還原能力，能夠向缺電子自由基提供質(zhì)子，但不能直接說明抗氧化劑是通過清除自由基來表現(xiàn)抗氧化活性。因此，還原能力測定常與自由基清除能力測定聯(lián)合使用，來評價抗氧化劑的活性是否通過電子轉(zhuǎn)移(electron transfer，ET)途徑清除自由基實現(xiàn)。

1.2 自由基清除能力測定

自由基清除能力測定，是在自由基溶液中加入抗氧化劑，根據(jù)所產(chǎn)生的光學(xué)差異來反映抗氧化活性。自由基清除能力測定是最常用的抗氧化活性評價方法，其反應(yīng)機理有電子轉(zhuǎn)移[22-23]、氫轉(zhuǎn)移(hydrogen atom transfer，HAT)及脂質(zhì)過氧化抑制機制。

1.2.1 基于電子轉(zhuǎn)移的自由基清除能力測定

自由基的種類可分為氮自由基和氧自由基?；陔娮愚D(zhuǎn)移的自由基清除能力測定主要有ABTS法、DPPH法、PTIO法和·OH法等，由于ABTS自由基在水與醇溶液中有良好的溶解性，因此ABTS法可用來評價絕大多數(shù)抗氧化劑的活性[24-25]；DPPH自由基是醇溶性自由基[26]，因此DPPH法僅能用來評價醇溶性或者樣品量相對較少的水溶性抗氧化劑的活性，且當(dāng)水溶性抗氧化劑的量較多時，可能會產(chǎn)生絮狀漂浮物，特別是多糖類抗氧化劑[27]。PTIO自由基是水溶性的一氧化氮自由基，PTIO法是近幾年開發(fā)的抗氧化活性評價方法，已被Li[28]證實可用于評價大多數(shù)抗氧化劑的活性。ABTS、DPPH、PTIO自由基的清除機理(圖1)均為：過氧自由基(ROO·)溶液在抗氧化劑(以抗壞血酸為例)的作用下，得到電子或/和發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移從而被清除[29-30]，而自由基溶液會發(fā)生顏色變化，據(jù)此可評價抗氧化劑的活性。

圖1 ABTS、DPPH、PTIO自由基的清除機理Fig.1 Scavenging mechanism of ABTS,DPPH,and PTIO free radicals

(1)

(2)

2半脫氫抗壞血酸+2H2O+Fe2+

(3)

1.2.2 基于氫轉(zhuǎn)移的自由基清除能力測定

氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法是一個經(jīng)典的基于氫轉(zhuǎn)移的自由基清除能力測定方法，是利用自由基產(chǎn)生劑(AAPH)產(chǎn)生氫過氧自由基，與熒光物質(zhì)3′，6′-dihydroxy spiro[isobenzo furan-1[3H]，9′[9H]-xanthen]-3-one(FL)反應(yīng)生成非熒光物質(zhì)FL4，整個過程可以用FL的過氧化機制(圖2)闡明[38]。抗氧化劑可以抑制或消除氫過氧自由基以減少FL4的生成，從而產(chǎn)生光學(xué)差異，基于抗氧化活性與熒光衰退曲線延緩部分面積(Net AUC)相關(guān)(圖3)來評價其抗氧化活性，結(jié)果一般以O(shè)RAC值表示[39]。

圖2 FL的過氧化機制Fig.2 Peroxidation mechanism of FL

圖3 抗氧化活性與熒光衰退曲線延緩部分面積(Net AUC)的關(guān)系曲線Fig.3 Relationship curve of antioxidant activity and Net AUC of fluorescence decay curve

總自由基清除能力(total radical-trapping antioxidant parameter，TRAP)法的反應(yīng)機理與ORAC法相同，但該法的熒光底物是R-藻紅蛋白，抗氧化活性與熒光衰退曲線最大斜率的滯后期相關(guān)[40]。

此外，基于氫轉(zhuǎn)移的自由基清除能力測定方法還有β-胡蘿卜素漂白法[43-44]，即β-胡蘿卜素亞油酸體系中的亞油酸會發(fā)生自氧化產(chǎn)生自由基使β-胡蘿卜素褪色，而抗氧化劑會延遲褪色時間，基于吸光度的變化可評價抗氧化活性，結(jié)果一般以抑制率表示。

1.2.3 基于脂質(zhì)過氧化抑制機制的自由基清除能力測定

脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸自氧化生成不穩(wěn)定的脂質(zhì)過氧化物，再進一步分解產(chǎn)生ROS、氫過氧化物及丙二醛等一系列自由基，這些自由基會引起細胞膜功能障礙、生物酶活性降低、細胞成分降解，導(dǎo)致細胞氧化損傷，與人體的動脈粥樣硬化、高血糖、高血脂等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[45-47]。在評價抗氧化劑的體外抗氧化活性時，最常用的是脂質(zhì)過氧化抑制實驗：以小鼠肝臟勻漿[48]、小鼠肝臟線粒體懸浮液[49]或雞蛋黃勻漿[50]作為脂質(zhì)源，氧化分解產(chǎn)生丙二醛及其類似物，采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法測定，而抗氧化劑會抑制丙二醛及其類似物的生成，致使反應(yīng)溶液的吸光度發(fā)生改變，基于空白組與實驗組之間的光學(xué)差異來評價抗氧化劑的抗氧化活性。

1.3 溯源抑制作用測定

溯源抑制就是追溯本源，抑制上游氧化酶活性，減少ROS等自由基的生成，抑制氧化反應(yīng)的發(fā)生，從而達到抗氧化的目的。當(dāng)下研究熱點是黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)，在核酸的分解代謝中，XOD不僅會催化黃嘌呤與次黃嘌呤氧化生成尿酸，而且能夠產(chǎn)生超氧陰離子和過氧化氫等過氧化物自由基，因此抑制XOD活性能夠間接減少體內(nèi)自由基的生成[51]。在評價抗氧化劑的體外抗氧化活性時，常以黃嘌呤為底物、XOD為反應(yīng)劑，XOD催化黃嘌呤產(chǎn)生的尿酸于290 nm處顯示特征吸收峰，而抗氧化劑會抑制XOD的活性，減少尿酸的生成，致使吸光度發(fā)生變化，基于空白組與實驗組之間的光學(xué)差異來評價抗氧化劑的抗氧化活性，結(jié)果一般以抑制率[52-53]或相對活性[51]表示。

2 細胞抗氧化活性法

CAA法是以細胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的活性評價方法，用來研究抗氧化藥物分配進入細胞膜、被吸收、與載體或酶等生物大分子相互作用、清除細胞內(nèi)氧自由基的有效方法，能更準(zhǔn)確、更接近地闡述抗氧化藥物在生物體體內(nèi)的抗氧化反應(yīng)機理，比化學(xué)分析法更具生物相關(guān)性。CAA法率先由Wolfe等[54]以人肝癌細胞HepG2為模型提出，其反應(yīng)機理如圖4所示。

圖4 細胞抗氧化活性法的反應(yīng)機理Fig.4 Reaction mechanism of cellular antioxidant activitymethod

HepG2細胞用抗氧化劑(AOX)與本身無熒光的指示劑2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)的混合物預(yù)處理；抗氧化劑結(jié)合在細胞膜上，并通過細胞膜進入細胞；DCFH-DA擴散到細胞中，細胞酯酶裂解二乙酸部分，在細胞內(nèi)形成極性更強的還原型二氯熒光素(DCFH)；然后用2，2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)處理細胞，ABAP能夠擴散到細胞中產(chǎn)生ROO·；ABAP能自發(fā)分解產(chǎn)生ROO·，ROO·攻擊細胞膜產(chǎn)生更多的自由基或ROS；細胞內(nèi)的DCFH極易被ROO·和ROS氧化為有熒光的氧化型二氯熒光素(DCF)?？寡趸瘎┛稍诩毎馇宄蚪Y(jié)合ROO·，并且能清除或結(jié)合細胞內(nèi)的ROO·和ROS,防止DCFH的氧化，減少DCF的形成，基于空白組與實驗組之間的光學(xué)差異來評價抗氧化劑的抗氧化活性。

在CAA法建立后，許多研究小組在此基礎(chǔ)上，使用不同的致傷劑建立氧化應(yīng)激模型，如張業(yè)尼等[55]和Zhao等[56]建立了以過氧化氫誘導(dǎo)HepG2細胞的氧化應(yīng)激模型；龔業(yè)滔等[57]建立了以乙酰氨基酚誘導(dǎo)HepG2細胞的氧化應(yīng)激模型。此外，為了更好地模擬抗氧化劑作用機體的效果，往往會根據(jù)抗氧化劑作用機理和目標(biāo)作用部位，選擇特定的細胞株，如人肝細胞L02[58-59]、人結(jié)腸癌細胞Caco-2[60-61]等。

3 結(jié)語

不同評價方法的實驗原理、適用范圍各不相同，所得結(jié)果也有差異?；瘜W(xué)分析法較CAA法簡單，實驗周期短，但不能全面反映抗氧化劑的活性及其在生物細胞內(nèi)的吸收、代謝和利用等情況。若要準(zhǔn)確地評價抗氧化活性，需同時采用多種方法。如將不同自由基清除能力相結(jié)合、化學(xué)分析法與CAA法相結(jié)合等，以綜合評價抗氧化活性。此外，還必須結(jié)合抗氧化劑的作用部位、溶解性等諸多因素選擇評價方法，從而客觀、準(zhǔn)確地評價抗氧化活性。