林 璐，彭 輝，聶志奎

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.江西新瑞豐生化股份有限公司，江西 新干 331300)

赤霉素(GAs)是一種四環(huán)二萜類(lèi)化合物，至今已發(fā)現(xiàn)136種，其中活性最強(qiáng)的是GA3[1]。赤霉素作為植物五大激素之一，是一種天然植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可使種子提前結(jié)束休眠、誘導(dǎo)種子發(fā)芽、促進(jìn)莖干生長(zhǎng)、誘導(dǎo)開(kāi)花等，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和釀造業(yè)，經(jīng)濟(jì)效益顯著，市場(chǎng)前景廣闊[2]。工業(yè)上主要通過(guò)藤倉(cāng)赤霉菌深層液體發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素，但野生藤倉(cāng)赤霉菌只能少量積累赤霉素，導(dǎo)致赤霉素生產(chǎn)成本較高、產(chǎn)量較低。因此，有必要對(duì)藤倉(cāng)赤霉菌進(jìn)行誘變選育以提高赤霉素產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本[3]。傳統(tǒng)誘變隨機(jī)性大，篩選工作量較大。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的微生物誘變技術(shù)，不僅操作簡(jiǎn)單、成本低，而且對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷機(jī)制多樣，可以提高獲得正向突變菌株的概率，對(duì)代謝途徑復(fù)雜的次級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的誘變具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[4-5]。

研究報(bào)道，赤霉素與麥角固醇共用前體物質(zhì)香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)[6]。麥角固醇是真菌細(xì)胞壁的重要組成成分，一旦合成受阻勢(shì)必導(dǎo)致菌體死亡。酮康唑是一種咪唑類(lèi)廣譜抗真菌藥物，通過(guò)高度選擇性干擾真菌的細(xì)胞色素P450的活性來(lái)抑制麥角固醇的生物合成。因此，以酮康唑?yàn)楹Y選壓力篩選出的抗高濃度酮康唑突變菌株勢(shì)必具有較強(qiáng)的麥角固醇合成能力，相應(yīng)地，也勢(shì)必具有較強(qiáng)的赤霉素合成潛力。

因此，作者以酮康唑?yàn)楹Y選壓力，對(duì)一株低產(chǎn)赤霉素的藤倉(cāng)赤霉菌進(jìn)行ARTP誘變；然后以GA3產(chǎn)量為指標(biāo)，通過(guò)初篩、復(fù)篩獲得赤霉素高產(chǎn)菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究，以獲得遺傳穩(wěn)定的赤霉素高產(chǎn)菌株，為其工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

藤倉(cāng)赤霉菌(Fusariumfujikuroi)CICC 2444，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

PDA斜面培養(yǎng)基(g·L-1)：馬鈴薯塊200，葡萄糖20，瓊脂15；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖30，酵母膏5.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO41.5，NaMoO4·2H2O 0.05，微量元素溶液1 mL；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖60，酵母膏5.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO41.5，NaMoO4·2H2O 0.05，微量元素溶液1 mL；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖80，酵母膏5.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO41.5，NaMoO4·2H2O 0.05，微量元素溶液1 mL；pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

微量元素溶液(mg·L-1)：H3BO3300，MnCl2·4H2O 100，ZnSO4·7H2O 100，F(xiàn)eCl3·6H2O 200，CuCl2·2H2O 500。配制方法：稱(chēng)取各成分溶于少量水中，然后滴加鹽酸至溶液澄清，再定容至所需的體積。

1.2 培養(yǎng)方法

PDA斜面培養(yǎng)：在超凈臺(tái)中吸取甘油管中的藤倉(cāng)赤霉菌液200 μL接種到PDA斜面培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)2～3 d，直至菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)斜面。

種子培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的菌種斜面，用無(wú)菌水洗下菌絲體，接種于種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)36 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：取種子培養(yǎng)液，按5%接種量接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)10 d。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：取種子培養(yǎng)液，按5%接種量接種于NBS 7.5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r·min-1、1 vvm條件下培養(yǎng)10 d。

1.3 菌懸液的制備

取種子培養(yǎng)液5 mL，離心，去上清；用生理鹽水洗滌2次后將菌體移入裝有50 mL無(wú)菌水、底部鋪滿玻璃珠的錐形瓶中，于28 ℃、200 r·min-1振蕩20 min；取樣，梯度稀釋?zhuān)坎加谄桨澹?8 ℃培養(yǎng)2 d后測(cè)定菌落數(shù)，確定菌懸液濃度在105～106個(gè)·mL-1之間。

1.4 酮康唑致死濃度的確定

將一定量酮康唑溶于65%乙醇中，配制成濃度為3 mg·L-1的酮康唑乙醇溶液。取適量酮康唑乙醇溶液加入配制好的平板中，使其濃度分別為5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、50 mg·L-1，以未加酮康唑乙醇溶液的平板為對(duì)照組；取100 μL菌懸液涂布于平板，于28 ℃培養(yǎng)2 d后測(cè)定菌落數(shù)，按式(1)計(jì)算致死率：

(1)

1.5 ARTP誘變

ARTP誘變儀(思清源生物有限公司)的操作參數(shù)：功率100 W，氦氣流速10 L·min-1，氣壓0.1 MPa。操作前，對(duì)操作室進(jìn)行紫外滅菌30 min；然后取10 μL菌懸液均勻涂于載片上，置于ARTP誘變儀中分別誘變30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s，以未誘變?yōu)閷?duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行；再移入裝有1 mL無(wú)菌水的EP管中，于振蕩器上振蕩1 min，形成新的菌懸液；最后將新菌懸液涂布于平板，于28 ℃培養(yǎng)2 d后測(cè)定菌落數(shù)，按式(2)計(jì)算致死率：

(2)

1.6 赤霉素高產(chǎn)菌株的篩選

初篩：將經(jīng)過(guò)ARTP誘變的菌懸液涂布于含有致死濃度的酮康唑平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d后測(cè)定菌落數(shù)，并將菌落保存。

復(fù)篩：將初篩得到的菌落接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定GA3產(chǎn)量，保存產(chǎn)量較高的菌株。

遺傳穩(wěn)定性考察：將復(fù)篩得到的菌株在PDA斜面上進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn)，測(cè)定每代菌株的GA3產(chǎn)量，并與傳代前進(jìn)行比較，以考察赤霉素高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.7 分析方法

菌株生物量：采用干重法測(cè)定。取一定量的菌液，真空抽濾，去離子水洗滌2次，得到的菌絲體經(jīng)60 ℃恒溫烘干至恒重。

葡萄糖含量：取一定量的發(fā)酵液，離心，取上清液100 μL定容至10 mL，用SBA-40C生物傳感器檢測(cè)。

GA3產(chǎn)量：采用高效液相色譜法測(cè)定。取一定量發(fā)酵液，12 000 r·min-1離心5 min，上清液用0.22 μm水系膜過(guò)濾后，裝入液相進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行液相分析。色譜條件：Dionex U3000型高效液相色譜儀，Venusil MP C18色譜柱(填料粒徑5 μm，Agela Technologies)，流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸(體積比68∶32∶0.05)，流速0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 酮康唑致死濃度的確定

取100 μL菌懸液涂布于不同濃度酮康唑平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d后計(jì)算致死率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酮康唑濃度對(duì)菌株致死率的影響Fig.1 Effect of ketoconazole concentration on lethality rate of strain

由圖1可知，隨著平板中酮康唑濃度的增加，菌株致死率快速升高，在酮康唑濃度增至30 mg·L-1時(shí)，菌株致死率達(dá)到100%；之后，繼續(xù)增加酮康唑濃度，致死率變化不大。因此，確定酮康唑致死濃度為30 mg·L-1。

2.2 ARTP誘變時(shí)間的確定

研究[7]發(fā)現(xiàn)，致死率越低，正向突變菌株越多，但高產(chǎn)菌株較少；而致死率越高，雖然負(fù)向突變菌株越多，但可能存在高產(chǎn)菌株。所以，致死率在70%～80%時(shí)的誘變效果是最理想的。為確定最佳ARTP誘變時(shí)間，取10 μL菌懸液，分別誘變不同時(shí)間，28 ℃培養(yǎng)2 d后計(jì)算致死率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 誘變時(shí)間對(duì)菌株致死率的影響Fig.2 Effect of mutagenesis time on lethality rate of strain

由圖2可知，隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株致死率不斷升高，當(dāng)誘變時(shí)間為90 s時(shí)，致死率接近100%；而當(dāng)誘變時(shí)間為70 s時(shí)，致死率為75.1%。所以，選擇70 s為最佳的ARTP誘變時(shí)間。

2.3 突變菌株的篩選

將菌懸液經(jīng)ARTP誘變70 s后，涂布于含有30 mg·L-1酮康唑的平板上，經(jīng)過(guò)初篩，挑選生長(zhǎng)良好的菌株接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，測(cè)定生物量和GA3產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 突變菌株的發(fā)酵性能

由表1可知，經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩，獲得12株GA3產(chǎn)量明顯高于出發(fā)菌株的突變菌株。與出發(fā)菌株相比，突變菌株的葡萄糖含量與生物量均相差不大，可知ARTP誘變并不影響菌體的正常生長(zhǎng)；而目標(biāo)代謝產(chǎn)物GA3產(chǎn)量卻相差較大，其中突變菌株1-6-4與3-6-1的GA3產(chǎn)量分別達(dá)到186.86 mg·L-1和194.64 mg·L-1，較出發(fā)菌株分別提高了57%和64%。故，選擇突變菌株1-6-4與3-6-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

作為理想的工業(yè)化菌株，遺傳穩(wěn)定是關(guān)鍵特性之一。將突變菌株1-6-4與3-6-1分別進(jìn)行10次斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)，測(cè)定每代菌株的GA3產(chǎn)量，并與傳代前進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，傳代9次后，突變菌株1-6-4與3-6-1的GA3產(chǎn)量均趨于穩(wěn)定，但菌株3-6-1的發(fā)酵性能明顯優(yōu)于菌株1-6-4，GA3產(chǎn)量穩(wěn)定在180.00 mg·L-1左右，較傳代前(194.64 mg·L-1)僅降低約7.52%。

圖3 突變菌株1-6-4與3-6-1的遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stability of mutant strains 1-6-4 and 3-6-1

2.5 赤霉素高產(chǎn)菌株發(fā)酵罐放大驗(yàn)證

利用7.5 L發(fā)酵罐對(duì)赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1的發(fā)酵性能進(jìn)行放大驗(yàn)證。分時(shí)取樣測(cè)定葡萄糖含量、pH值、生物量及GA3產(chǎn)量，并與出發(fā)菌株的發(fā)酵性能進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示。

圖4 赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1與出發(fā)菌株的7.5 L發(fā)酵罐發(fā)酵性能比較Fig.4 Comparison of fermentation performance of high-yield Gibberellin-producing strain 3-6-1 and original strain cultured in 7.5 L fermentor

由圖4可知：(1)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1和出發(fā)菌株的發(fā)酵液中葡萄糖含量均呈下降趨勢(shì)，且高產(chǎn)菌株3-6-1發(fā)酵液中的葡萄糖含量略高于出發(fā)菌株，表明高產(chǎn)菌株3-6-1的葡萄糖消耗量略低于出發(fā)菌株；發(fā)酵0～24 h耗糖速率明顯低于出發(fā)菌株，24 h后耗糖速率基本相同，說(shuō)明高產(chǎn)菌株3-6-1的延滯期相對(duì)較長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力較差。(2)赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1和出發(fā)菌株的發(fā)酵液pH值均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降直至平穩(wěn)；發(fā)酵0～24 h，高產(chǎn)菌株3-6-1的發(fā)酵液pH值低于出發(fā)菌株，24 h后，就明顯高于出發(fā)菌株。這可能是由于，出發(fā)菌株在代謝過(guò)程中產(chǎn)生了更多的酸性物質(zhì)。(3)菌株生物量的變化規(guī)律與葡萄糖含量的相反，即隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，高產(chǎn)菌株3-6-1的生物量略低于出發(fā)菌株。(4)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1和出發(fā)菌株的GA3產(chǎn)量變化趨勢(shì)基本相同，即發(fā)酵48 h后，GA3產(chǎn)量均開(kāi)始快速增加，但高產(chǎn)菌株3-6-1的GA3合成速率明顯高于出發(fā)菌株，發(fā)酵終產(chǎn)量達(dá)到235.98 mg·L-1，較出發(fā)菌株提高了87.2%。這可能是由于，pH值是影響GA3產(chǎn)量的重要因素，高產(chǎn)菌株3-6-1的發(fā)酵液pH值更適宜合成GA3。

3 結(jié)論

以藤倉(cāng)赤霉菌CICC 2444為出發(fā)菌株，采用ARTP誘變，獲得了系列突變菌株，并基于赤霉素代謝途徑的分析，根據(jù)赤霉素和細(xì)胞壁關(guān)鍵成分麥角固醇共享前體物質(zhì)GGPP這一特征，選擇抑制麥角固醇生物合成的酮康唑?yàn)楹Y選壓力，篩選耐受高濃度酮康唑的突變菌株，建立了一種基于ARTP誘變結(jié)合酮康唑?yàn)楹Y選壓力的GA3高產(chǎn)菌株的選育方法。經(jīng)過(guò)抗性初篩和搖瓶復(fù)篩，獲得一株赤霉素高產(chǎn)菌株3-6-1，GA3產(chǎn)量達(dá)194.64 mg·L-1，較出發(fā)菌株提高了64%。經(jīng)傳代實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該菌株遺傳穩(wěn)定性良好；經(jīng)7.5 L發(fā)酵罐分批放大培養(yǎng)，該菌株的發(fā)酵終產(chǎn)量為235.98 mg·L-1，較出發(fā)菌株提高了87.2%，具備成為工業(yè)菌株的潛力。所建立的赤霉素高產(chǎn)菌株誘變篩選方法既減少了篩選工作量，也提高了篩選到高產(chǎn)菌株的概率，為高產(chǎn)菌株的選育提供了借鑒。