李立恒 蔡晶 嚴強 劉虹 韓月臣*

1湖州市中心醫(yī)院（湖州師范學院附屬中心醫(yī)院）耳鼻喉科（湖州 313099）

2山東省耳鼻喉醫(yī)院耳鼻喉研究所（濟南 250023）

3湖州市智能數(shù)字精準外科重點實驗室（湖州 313002）

周圍性面癱是臨床上常見疾病，其發(fā)病原因包括外傷，感染，炎癥反應，病毒等。其中外傷造成面神經(jīng)損傷的關鍵原因之一。面神經(jīng)是第七對腦神經(jīng)，屬于運動神經(jīng)為主的混合神經(jīng)，支配面部表情肌作用[1]。當其出現(xiàn)損傷后，患者會出現(xiàn)額紋消失、鼻唇溝變淺等面癱的癥狀。同時面神經(jīng)損傷的修復與再生過程復雜。研究表明[2]面神經(jīng)損傷的修復可能與腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌水平相關。目前臨床上主要通過激素類藥物，全身或局部應用神經(jīng)營養(yǎng)因子，干細胞治療、針灸等治療手段對周圍性面癱進行治療[3]。

溴莫尼定(Brimonidine)，屬于α-2-ARs高度選擇性激動劑，是臨床青光眼治療的一線藥物，具有穩(wěn)定且顯著的降眼壓治療效果[4]。同時其對耳神經(jīng)的損傷也有一定的修復作用[5]。本研究通過對溴莫尼定的大鼠面神經(jīng)夾挫傷治療效果進行觀察，并進一步研究其作用機制，可幫助我們深入了解溴莫尼定促進面神經(jīng)損傷的修復和再生。

1 實驗材料與設備

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雌性大鼠100只，體重平均200g，飼養(yǎng)于山東省耳鼻喉醫(yī)院動物房，恒溫恒濕，每日提供正常充足的純凈水及專用食物，實驗經(jīng)山東大學倫理委員會批準(倫理批號2017121101)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥

將動物隨機分為3組：假手術組、手術后自然恢復組以及手術后溴莫尼定治療組。其中假手術組含10只正常大鼠，僅手術暴露面神經(jīng)，不做面神經(jīng)夾挫傷處理，僅作對照。對80只正常大鼠進行面神經(jīng)夾挫傷造模，根據(jù)其損傷后評分隨機分為自然恢復組及溴莫尼定組，每組各含40只大鼠。溴莫尼定組：每隔三日給予溴莫尼定（UK-14303）腹腔注射10mg/kg，持續(xù)3周[5];自然恢復組給予注射等量的生理鹽水，持續(xù)3周。每周動物行電生理檢查后處死取下面神經(jīng)及核團行相應的病理及WB檢查。

1.2.2 大鼠面神經(jīng)夾挫傷動物模型制作

制作前對器械進行消毒。大鼠耳后剃毛發(fā)，消毒表面皮膚，沿耳后溝切開皮膚，鈍性撐開肌肉筋膜，暴露面神經(jīng)主干后用血管鉗鉗夾主干3次,如圖1，每次持續(xù)10s，三次之間間隔10s[6]。

圖1 A:面神經(jīng)主干夾挫傷；B:造模成功的大鼠（左側(cè)面部不能閉眼，左側(cè)胡須不能活動，鼻尖偏向右側(cè)）Fig.1 A:Facial nerve trunk clamp contusion;B:Rats with successful modeling(eyes can’t closed on the left side,no movement in the left side of the beard,the tip of the nose was tilted to the right side).

1.2.3 面神經(jīng)功能評價

對各組大鼠分別于開始給藥后的第1,7,14,21天進行其面神經(jīng)功能評價，由兩名研究人員觀察各組大鼠行為進行并記錄。觀察項目如下：面神經(jīng)功能評分（瞬目反射、觸須運動），評分標準見表1和表2.最終將瞬目反射及觸須運動評分結(jié)果進行評分。根據(jù)獲得的評分總值，留待后續(xù)進行統(tǒng)計學分析。

表1 大鼠瞬目反射評分表Table 1 Rat blink reflex rating table

表2 大鼠觸須運動評價表Table 2 Evaluation table of palpate movement in rats

1.2.4 電生理檢查

正?；謴徒M及溴莫尼定組模型滿1周，2周，3周后采用面神經(jīng)肌電圖（ENoG）對大鼠的神經(jīng)功能進行評價：面部安裝好電極后，刺激強度為0.1 mA，測定其面神經(jīng)的CMAPs波。記10次刺激后，得到CMAPs的潛伏期及最大振幅，然后取平均值[6]。

1.2.5 準備

完成電生理檢測的大鼠用水合氯醛深度麻醉后切開原傷口轉(zhuǎn)移至顯微鏡下，顯露面神經(jīng)主干，截取面神經(jīng)主干損傷處上下約2mm長度面神經(jīng)，轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛內(nèi)浸泡過夜備用，部分神經(jīng)組織做HE染色，部分神經(jīng)組織做免疫組化。取下神經(jīng)后動物拉頸處死，動物處死符合倫理學規(guī)范，剪下頭部并獲取完整的腦組織，保留腦干，面神經(jīng)核團定位于大鼠腦干接近延髓腹外側(cè)面[6]。取出核團組織做WB。

1.2.6 HE染色

面神經(jīng)組織放入二甲苯中浸泡，石蠟包埋，將石蠟切片機切片設置為4 μm厚度，包埋好的組織進行橫斷面切片，切取的神經(jīng)組織用載玻片轉(zhuǎn)移至溫箱中，65℃烘烤2h，烘烤完成后取出標記。行脫蠟水洗分化，復染，脫水，封片，鏡下觀察。

1.2.7 免疫組化法檢測S100蛋白表達

將部分神經(jīng)組織用oct膠固定后冰凍切片機按4 u m厚度切片，切取的神經(jīng)組織用載玻片清洗破膜封閉后滴加S100（濃度1:1000，CST公司）一抗；二抗，DAB顯色；流水沖洗切片，室溫下干燥，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察得到的使用Image pro Plus 6.0軟件分析測定鏡下陽性細胞數(shù)[6]。

1.2.8 Western Blot檢測面神經(jīng)核團組織蛋白表達水平

取面神經(jīng)核團組織，蛋白樣品濃度測定，配膠上樣，電泳轉(zhuǎn)膜，抗體孵育FGF2（1:2000 CST公司）及S100（1:1000 CST公司）蛋白，暗室照相[7]。利用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并保存，掃描后使用Image J軟件分析每個孔的灰度值，以每個樣品的內(nèi)參作為對照，標準化后，統(tǒng)計結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS19.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物評分結(jié)果

在完成溴莫尼定給藥干預21天后，見表3，溴莫尼定組的面癱評分較自然恢復組顯著降低，差異具有顯著性（P＜0.05），其余時間段各組大鼠面癱評分雖均具有一定的下降，但均無顯著差異，差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠各時間段面癱評分平均值表Table 3 Average score of facial paralysis in each group at different time periods

本研究對各組大鼠各時間段觸須反射進行評價，發(fā)現(xiàn)溴莫尼定組其觸須反射均較自然恢復組恢復程度好，這可能是由于自然恢復組的恢復依賴機體自身的神經(jīng)修復能力，具有較大的個體差異，同時溴莫尼定對神經(jīng)具有一定的恢復再生效果。同時組間比較結(jié)果顯示，在藥物治療21天，溴莫尼定組其治療效果顯著優(yōu)于自然恢復組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 電生理結(jié)果

當大鼠面神經(jīng)主干損傷后，數(shù)據(jù)見表4，自然恢復組其面神經(jīng)CMAPs潛伏期顯著延長，且波幅降低，在術后第21天時，溴莫尼定組大鼠的潛伏期明顯縮短，波幅顯著升高，與自然恢復組存在顯著差異，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），圖2表明溴莫尼定對面神經(jīng)損傷具有一定的損傷修復作用。

表4 各組大鼠各時間段電生理表Table 4 Electrophysiology of rats in each group at different time periods

2.3 組織HE染色

本研究發(fā)現(xiàn)正常面神經(jīng)神經(jīng)鞘及其周圍分界清楚明顯，分組給藥干預2周后，見圖3各組大鼠可見有髓神經(jīng)纖維，可見少量髓鞘碎片，軸突橫截面積較厚但不均勻;給藥干預3周后，自然恢復組及溴莫尼定組均可見髓鞘崩解碎片。組間比較后，發(fā)現(xiàn)溴莫尼定干預3周后，溴莫尼定組的面神經(jīng)形態(tài)較自然恢復組恢復程度高，其新生髓鞘數(shù)量及厚度明顯高于自然恢復組。

2.4 免疫組化

本研究通過對S100蛋白的表達水平進行免疫組化檢測，見圖4，自然恢復組及溴莫尼定組其S100（1:1000）蛋白水平較正常對照組顯著降低。溴莫尼定組治療干預3周后，S100蛋白的表達顯著高于自然恢復組，接近正常對照組，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖4 S-100蛋白表達的免疫組化分析。免疫組化染色顯示損傷面神經(jīng)胞漿中有S-100表達。對照組面神經(jīng)S-100表達較低。S-100在受損的面神經(jīng)和雪旺細胞中高表達。而3周后S-100表達水平下降，損傷+bri組S-100表達水平較損傷組低。Fig.4 Expression of S100 protein in each group.Immunohistochemical analysis of S-100 expression.Immunohistochemical staining showed s-100 expression in cytoplasm of injured facial nerve.The expression of S-100 in facial nerve was lower in control group.S-100 was highly expressed in damaged facial nerve and Schwann cells.After 3 weeks,the s-100 expression level decreased,and the S-100 expression level in the injury+BRI group was lower than that in the injury group.

2.5 WB

研究發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，自然恢復組與溴莫尼定組的FGF2以及S100均較正常對照組減少，見圖5。與自然恢復組相比，溴莫尼定組在進行治療的21天，S100、FGF2的表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且?guī)缀趸謴椭琳Ｋ?，表明溴莫尼定能夠有效修復面神?jīng)損傷，可能是通過FGF2及S100介導的。

圖5 各組的WB表現(xiàn)。a正常對照組；b自然恢復組；c溴莫尼定給藥1周；d給藥2周；e給藥3周。Fig.5 WB manifestations in each group.a normal control group;b natural recovery group;c brimonidine was injection for 1 week;d brimonidine for 2 weeks;e brimonidine for 3 weeks.

3 討論

溴莫尼定通常被應用于眼科青光眼的治療，使眼壓升高并改善眼部視力模糊的癥狀[4]，本次實驗為驗證該藥物對面神經(jīng)損傷的修復作用，實驗中損傷了面神經(jīng)的顳骨外段，比較容易建模，面神經(jīng)損傷后的評估包括：視覺的主觀評估，客觀評估，電生理檢查等[8]。本次實驗的面部表情評分和電生理證實了溴莫尼定的神經(jīng)保護作用，但電刺激有時候會滯后于臨床恢復?？赡芘c研究人員操作及電極的安放有關。潛伏期的延長可能由于髓鞘的不完整，影響了信號的傳導。面神經(jīng)是混合神經(jīng)，通常電生理比較準確的反應神經(jīng)傳導情況，本實驗中損傷了神經(jīng)的粗纖維使神經(jīng)傳導減弱，隨著神經(jīng)的恢復，傳導的潛伏期也逐漸縮短，振幅也隨之而增大，也反應了藥物治療的有效性。而通常神經(jīng)保護的藥物也會使?jié)摲诳s短和振幅增大。

在神經(jīng)損傷之后，雪旺細胞直接或間接與其他成纖維細胞和巨噬細胞相互作用，面神經(jīng)功能其傳導的效果受軸突的粗細、髓鞘厚度及長度影響。損傷后各組均出現(xiàn)髓鞘與周圍邊界模糊，髓鞘數(shù)量減少，軸突橫截面積縮小，表明神經(jīng)的傳導能力出現(xiàn)障礙[9]。面神經(jīng)的神經(jīng)元胞體位于腦干，一旦損傷，小膠質(zhì)細胞將聚集在損傷神經(jīng)胞體周圍[9]。在神經(jīng)夾挫傷的動物模型中，發(fā)生瓦倫變性，隨后，遠端軸索和髓鞘開始碎裂，施萬細胞幫助去除軸索和碎裂的髓鞘，并轉(zhuǎn)運給巨噬細胞，雪旺細胞和巨噬細胞的共同協(xié)作，促進組織恢復[9]。侯正玉[10]等制作視神經(jīng)夾挫傷并用溴莫尼定治療后用HE染色計數(shù)各組鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的數(shù)量,用透射電鏡觀察和比較各組鼠視網(wǎng)膜的超微結(jié)構(gòu)改變。并發(fā)現(xiàn)治療組較模型組視網(wǎng)膜形態(tài)損傷減輕.模型組和治療組較正常對照組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量明顯減少,但治療組較模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量明顯增加。并證明了溴莫尼定的神經(jīng)保護作用。

S100對維持鈣離子的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有關鍵作用。具有極高的生理活性，主要依賴神經(jīng)膠質(zhì)細胞分泌[11]。研究表明S100蛋白能夠刺激新生髓鞘數(shù)量的增加，提高神經(jīng)元的存活率。另一項研究表明[12]，局部注射S100蛋白能夠刺激坐骨神經(jīng)的損傷軸突修復，改善其損傷情況。腸道微生物群下發(fā)揮作用，由炎癥過程或腸腦軸介導，兩者都涉及到S100B蛋白作為一種擴散細胞因子的可能作用，S100鈣結(jié)合蛋白B(S100B)和神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)可能是反映雙相障礙患者神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元異常的外周標記物。成纖維細胞因子FGF能夠?qū)C體中的磷酸鹽進行調(diào)節(jié)，抑制羥化酶活性，下調(diào)活性維生素D的合成水平。促進損傷神經(jīng)元的再生，改善面神經(jīng)功能。最近研究發(fā)現(xiàn)FGF與聽覺系統(tǒng)耳蝸帶狀突觸，興奮性突觸的形成、維持及調(diào)控過程密切相關[13]。本次實驗也驗證了FGF在神經(jīng)恢復過程中調(diào)節(jié)機體的穩(wěn)態(tài)，促進了神經(jīng)系統(tǒng)的保護。近來，對溴莫尼定的機制研究涉及PI3KAKT，MAPK，Erk等信號通路[14]，可以通過這些研究了解，激活或者抑制相關的蛋白及上下游的相關因子，起到神經(jīng)的保護作用。

由此可見，溴莫尼定上調(diào)了FGF以及S100的表達水平，并且使神經(jīng)恢復再生，維持新生軸突數(shù)量及其保護了髓鞘結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，起到保護面神經(jīng)的作用.但具體的機制還需進一步研究。這為該藥物治療神經(jīng)損傷提供了更多的有價值的參考，本實驗對具體分子機制和影響因素還需進一步嚴格涉及，包括未計算神經(jīng)傳導速度，血藥濃度，給藥時間的對比等，今后還需更多的實驗來驗證溴莫尼定治療周圍神經(jīng)的可行性。

致謝：蔡晶參與研究設計和部分實驗內(nèi)容。