賈俊芳，孟德新，李淑霞，戴曉俠

（1.山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東威海 264210；2.濟(jì)南市章丘區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東濟(jì)南 250200）

古語(yǔ)云“一白遮百丑”，白皙的皮膚一直是愛(ài)美人士的追求，在護(hù)膚品中，美白祛斑類(lèi)產(chǎn)品一直廣受關(guān)注。但是近年來(lái)由于美白化妝品的需求巨大，使得一些不法商人利用大家的愛(ài)美之心，牟取暴利。根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理網(wǎng)站通報(bào)，可以看出美白祛斑類(lèi)化妝品成為化妝品違法的重災(zāi)區(qū)，由于不合格產(chǎn)品導(dǎo)致的皮膚損傷以及身體損傷也常見(jiàn)報(bào)道。中藥因其主要來(lái)源于植物，溫和安全，近年來(lái)成為美容護(hù)膚研究的熱門(mén)原料。目前對(duì)于中藥美白作用的研究越來(lái)越多，越來(lái)越深入，有文獻(xiàn)報(bào)道具有酪氨酸酶抑制活性的中藥有人參、甘草、紅景天、黃芩、當(dāng)歸、川芎等，其中甘草、人參抑制活性最為明顯[4-14]。三白湯來(lái)源于明代的《醫(yī)學(xué)入門(mén)》，由白芍、白術(shù)、白茯苓、甘草組成，水煎，溫服。此方配伍簡(jiǎn)潔精當(dāng)，適于氣血虛寒導(dǎo)致的皮膚粗糙、萎黃、黃褐斑、色素沉著等[15]。但是三白湯作為具有美容作用的傳統(tǒng)方劑，目前有研究證實(shí)白芍多糖、茯苓三萜、甘草苷、甘草酸等均具有酪氨酸酶抑制活性，白術(shù)具有較好的抗氧化活性[16-21]。但關(guān)于方劑三白湯的美白活性研究和現(xiàn)代應(yīng)用均較少，本文將對(duì)不同溶劑的三白湯提取物的體外酪氨酸酶抑制活性進(jìn)行對(duì)比，考察其美白效果，同時(shí)篩選最佳提取工藝，為制備安全、高效的天然美白產(chǎn)品提供理論依據(jù)。皮膚的顏色取決于皮膚中黑色素的數(shù)量，黑色素由人體表皮基底層的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生。黑色素細(xì)胞中的酪氨酸在酪氨酸酸酶的催化下羥化為3,4-二羥基苯丙氨酸，即多巴，進(jìn)一步氧化作用下形成多巴醌。從多巴醌可通過(guò)兩條不同的途徑生成真黑素與褐黑素。由此可以看出，酪氨酸氧化是黑色素合成的起始步驟，酪氨酸酶是黑色素合成中的關(guān)鍵限速酶。黑色素的生成和轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，除酪氨酸酶外，還有多巴色素互變酶、過(guò)氧化物酶、DHICA氧化酶等，同時(shí)黑色素細(xì)胞的數(shù)量、活性也對(duì)黑色素?cái)?shù)量有影響[1-2]。根據(jù)黑色素生產(chǎn)原理可以發(fā)現(xiàn)，皮膚美白的主要方法為減少黑色素沉積，目前主要的方法有：抑制黑色素形成；還原黑色素，防止光氧化；促進(jìn)黑色素代謝；防止紫外線進(jìn)入等。根據(jù)文獻(xiàn)分析，顯示研究得最多的是抑制黑色素的生成。美白作用主要的評(píng)價(jià)方法為生物化學(xué)法，在體外考察美白成分對(duì)酪氨酸酶活性影響；細(xì)胞生物學(xué)法，以人黑素細(xì)胞、鼠黑素瘤細(xì)胞等為模型，考察美容成分對(duì)細(xì)胞黑色素?cái)?shù)量的影響；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以豚鼠、小鼠等為模型，應(yīng)用成分后考察其皮膚黑色素?cái)?shù)量變化；人體實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用于皮膚，通過(guò)膚色變化考察美白成分作用效果[3]。因此酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)可以對(duì)活性成分進(jìn)行初步的祛斑美白功效評(píng)價(jià)[4]。

1 材料與儀器

藥材：白芍（1907180143，產(chǎn)地補(bǔ)充）、白術(shù)（1904150032，產(chǎn)地四川），白茯苓（1906200522，產(chǎn)地遼寧），甘草（1902210312，產(chǎn)地江蘇），均購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為真品。

試劑：L-多巴（BR，西安潤(rùn)澤生物技術(shù)有限公司），蘑菇酪氨酸酶（25KU，BR，阿拉丁試劑有限公司），曲酸（BR，山東優(yōu)索化工科技有限公司），熊果苷（BR，山東優(yōu)索化工科技有限公司），磷酸鹽混合物（pH=6.8，AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠），無(wú)水乙醇（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），純凈水（AR，自制）。

超聲微波清洗器（KQ3200DE，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用儀器有限公司），恒溫水浴鍋（HH-4，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），pH計(jì)（PHSJ-4A，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），電子天平（LE204E，奧豪斯），手動(dòng)單道可調(diào)式移液器（100μL、200μL、1000μL，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器），小型多功能粉碎機(jī)（500g，廣州是渲龍廚具有限公司），金屬篩（40目，廣州是渲龍廚具有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試劑配制

磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=6.8）：將適量磷酸緩沖鹽用純凈水溶解，在250mL容量瓶中按照要求稀釋至刻度，搖勻。

酪氨酸酶溶液配制：將酪氨酸酶用上述配制的磷酸緩沖鹽溶解，配制成濃度為250U/mL的溶液。

L-多巴溶液配制：精密秤定L-多巴適量，加入上述配制好的磷酸緩沖鹽溶液，配制成濃度為5mg/mL的溶液。

2.2 不同溶劑三白湯提取物的制備

精密稱取白芍、白術(shù)、白茯苓、甘草各300g，將各藥材采用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，白芍、白術(shù)、白茯苓、甘草按照2∶2∶2∶1的比例混合均勻。稱取5g混合藥材粉末三份，分別加入50mL純凈水、50mL 50%乙醇、50mL乙醇，40℃超聲提取30min，過(guò)濾，將濾液蒸干，加入5mL配制好PBS溶解，備用。將溶解的提取物用磷酸緩沖鹽溶液稀釋成100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL，10mg/mL、5mg/mL、1mg/mL 6個(gè)濃度。

2.3 酪氨酸酶抑制活性測(cè)定

采用酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測(cè)，在對(duì)照組加入1.8mL配制好磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）和0.2mL酪氨酸酶溶液；空白組加入2mL磷酸鹽緩沖液，三白實(shí)驗(yàn)組加入磷酸鹽緩沖液0.8mL，酪氨酸酶溶液0.2mL和三白提取物溶液1.0mL；三白對(duì)照組加入磷酸鹽緩沖液1.0mL和三白提取物溶液1.0mL。以上溶液按要求移至試管，搖勻，置37℃水浴中溫育10min。取出后每個(gè)試管中加入L-多巴溶液1.0mL，反應(yīng) 2min 后于紫外分光光度計(jì)（475nm）測(cè)定其吸光度（A）值。

按下列公式計(jì)算酪氨酸酶的抑制率：

Aa=對(duì)照組樣品吸光度；Ab為空白組樣品吸光度，Ac為三白反應(yīng)組吸光度；Ad為三白對(duì)照組吸光度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 三白湯不同提取物酪氨酸酶抑制率

從圖1看出，不同溶劑三白湯提取物對(duì)酪氨酸酶活性均有不同程度的抑制作用，抑制活性均隨濃度的升高而增強(qiáng)，說(shuō)明三白提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制活性呈現(xiàn)濃度依賴性。在同等濃度下，50%乙醇提取物的抑制作用最強(qiáng)，抑制率高達(dá)86.19%，抑制活性非常明顯。

3 三白提取物最佳提取工藝考察

3.1 提取方式的考察

精確稱量三白湯粉末5g，加入10倍量的50%乙醇作為提取溶劑，其中一份藥材40℃超聲提取30min，一份藥材加熱回流1h，過(guò)濾，將濾液蒸干加配制好的磷酸緩沖鹽溶液溶解后，稀釋成濃度為50mg/mL溶液，按上述酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)比考察不同提取方式提取的三白提取物的酪氨酸酶抑制活性。

實(shí)驗(yàn)表明，提取方式加熱回流法制備的三白湯提取物與超聲法提取的三白提取物對(duì)酪氨酸酶抑制活性分別為83.33%和83.13%，二者區(qū)別不大，但超聲提取法操作更方便，同時(shí)時(shí)間更短，溫度也較低，減少活性成分分解，因此為了保護(hù)有效成分，提高提取效率，選擇超聲法作為三白提取物的提取方法。

3.2 提取溫度的考察

精確稱量三份三白湯粉末，加入10倍量的50%乙醇作為提取溶劑，分別在常溫（20～30℃）、40℃、50℃下超聲提取30min，過(guò)濾，將提取液蒸干加入配制好的磷酸緩沖鹽溶液溶解后，制備成濃度為50mg/mL溶液，按上述酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)方法考察不同提取溫度提取的三白提取物的酪氨酸酶抑制活性變化。

常溫下超聲提取，三白提取物酪氨酸酶抑制率為82.13%，40℃下提取抑制率為83.49%，50℃下提取抑制率為79.57%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在低于40℃時(shí)，隨著提取溫度的增加，三白提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制活性逐漸增加，但50℃提取時(shí)三白提取物對(duì)酪氨酸酶抑制活性降低，因此選擇40℃超聲提取作為三白提取物的提取溫度。

3.3 提取溶劑體積的考察

精確稱量三白湯粉末三份，加入8倍量、10倍量、12倍量的50%乙醇作為提取溶劑，40℃超聲提取30min，過(guò)濾，將提取液蒸干加配制好對(duì)磷酸緩沖鹽溶液溶解后，制備成濃度為50mg/mL溶液，按上述酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)比考察提取溶劑體積對(duì)三白提取物的酪氨酸酶抑制活性的影響。

8倍量體積比提取的三白提取物酪氨酸酶抑制率為80.24%，10倍量提取的抑制率為83.15%，12倍量提取物的抑制率為83.01%。實(shí)驗(yàn)表明，8倍量溶劑提取的提取物酪氨酸酶抑制活性較低，溶劑體積10倍和12倍對(duì)提取物酪氨酸酶活性影響不大，為了節(jié)約溶劑，因此選擇10倍量作為三白提取工藝的溶劑體積。

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，以酪氨酸酶活性抑制率為指標(biāo)，最終確定三白提取物的最佳提取工藝為：精密稱取白芍、白術(shù)、白茯苓、甘草適量，將各藥材采用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，白芍、白術(shù)、白茯苓、甘草按照2∶2∶2∶1的比例混合均勻。藥材按照精確稱定藥材粉末適量，加入10倍量的50%乙醇，40℃超聲法提取30min，制得三白提取物原液。

4 結(jié)束語(yǔ)

隨著國(guó)家對(duì)中醫(yī)藥發(fā)展的整體推動(dòng)及人們對(duì)中醫(yī)藥文化的了解深入，近年來(lái)對(duì)于中藥美白的研究越來(lái)越多，也越來(lái)越深入。三白湯作為傳統(tǒng)古方，長(zhǎng)期臨床應(yīng)用證明其具有較好的美白祛斑的功效，同時(shí)，三白湯四味藥物均被收錄于《已使用化妝品原料名稱目錄》，安全性得到保障，可以直接作為化妝品原料制備化妝品。雖然現(xiàn)在對(duì)于中藥美白作用的研究較多，但對(duì)于傳統(tǒng)方劑的美白作用研究較少。因?yàn)橹兴幊煞值膹?fù)雜性和質(zhì)量的不穩(wěn)定性，使其在現(xiàn)代護(hù)膚產(chǎn)品開(kāi)發(fā)應(yīng)用時(shí)存在很大困難。本文通過(guò)體外酪氨酸酶實(shí)驗(yàn)對(duì)三白湯提取物的美白活性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明三白湯50%乙醇提取物、乙醇提取物均有較好的酪氨酸酶抑制活性，同時(shí)以酪氨酸酶活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)三白湯提取物的制備條件進(jìn)行了考察，為三白湯系列美白產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。但是酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)對(duì)酪氨酸酶有較好作用的美白添加劑，而不能反映美白添加劑是否能透皮被吸收，也不能反映與黑色素合成有關(guān)的其他機(jī)制，因此，還需進(jìn)一步采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、人體皮膚實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，三白系列化妝品的開(kāi)發(fā)還需對(duì)三白提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，以保證穩(wěn)定的三白提取物含量的穩(wěn)定性。三白湯作為純天然植物成分，美白效果較好，提取方法簡(jiǎn)單易行，三白湯在美白祛斑化妝品應(yīng)用領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。