郝麗娟，徐艷梅，喬曉寧，閆凱，蓋成，高燕霞

(河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥質(zhì)量控制與評價重點實驗室，石家莊 050227)

鹽酸拉貝洛爾為國家基本藥物，別名為柳胺芐心定，具有α和β受體雙重阻滯活性，適用于各型高血壓，特別是妊娠高血壓[1-2]。鹽酸拉貝洛爾分子中含有酚羥基和酰胺基結(jié)構(gòu)，易被氧化和水解，在生產(chǎn)和貯藏過程中亦可能產(chǎn)生降解物，因其作為治療妊娠高血壓的重要藥物，對安全性有著更加嚴格的要求，故有關物質(zhì)的測定非常必要。鹽酸拉貝洛爾片的現(xiàn)行質(zhì)量標準和美國藥典(USP)、日本藥典(JP)均未設置有關物質(zhì)檢查項[3-5]；英國藥典(BP)2020年版中，有關物質(zhì)的測定采用薄層色譜(TLC)法[6]，分離度和準確度均較差。高效液相色譜(HPLC)法測定鹽酸拉貝洛爾原料和注射液的含量和有關物質(zhì)的文獻報道中，只對單一雜質(zhì)和總雜質(zhì)進行了控制，均未測定已知雜質(zhì)2-羥基-5-[1-羥基-2-[(1-甲基-3-苯丙基)氨基]乙基]苯甲酸(雜質(zhì)A)、2-羥基-5-[1-羥基-2-[(1-甲基-3-苯丙基)氨基]乙基]苯甲酸甲酯(雜質(zhì)B)和2-羥基-5-(2-(4-苯基丁-2-氨基)乙酰)苯甲酰胺(雜質(zhì)F)[7-8]，另外未見對鹽酸拉貝洛爾片進行有關物質(zhì)檢測的文獻報道。為有效提高藥物的安全性，筆者在系統(tǒng)考察鹽酸拉貝洛爾的工藝雜質(zhì)、合成中間體和降解產(chǎn)物的基礎上，參照相關研究資料[6-10，12-15]針對雜質(zhì)A、雜質(zhì)B 和雜質(zhì)F，建立了靈敏度高、專屬性好的HPLC 法，文獻中的HPLC 等度洗脫法未實現(xiàn)已知雜質(zhì)的分離，筆者采用HPLC 梯度洗脫法，對各雜質(zhì)實現(xiàn)了有效分離和同時準確定量，并且具有更低的檢測限，簡單快速，專屬性好，為有效控制鹽酸拉貝洛爾片的質(zhì)量提供了一種新方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20AT 型，日本島津公司。

電子天平：XS105 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

鹽酸拉貝洛爾對照品：質(zhì)量分數(shù)為99.8%，批號為1744-096A1，美國TLC 公司。

雜質(zhì)A 對照品：質(zhì)量分數(shù)為98.1%，批號為2228-052A3，美國TLC 公司。

雜質(zhì)B 對照品：質(zhì)量分數(shù)為99.6%，批號為2148-016A3，美國TLC 公司。

雜質(zhì)F對照品：質(zhì)量分數(shù)為100%，批號為008-190403，A 藥廠。

鹽酸拉貝洛爾片：(1)批號分別為08181102、08181202、08181201，A 藥 廠；(2) 批 號 分 別 為180202、180802、180901，B 藥廠。

乙腈：色譜純，德國默克EMD Millipore 公司。

磷酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

磷酸溶液：體積分數(shù)為0.1%，1 mL 磷酸加水至1 000 mL。

實驗用水為超純水。

1.2 溶液配制

混合雜質(zhì)對照品儲備液：3 種雜質(zhì)的質(zhì)量濃度均為0.125 g/L。精密稱取雜質(zhì)A、B、F 對照品各約12.5 mg，置于同一100 mL 容量瓶中，用磷酸溶液溶解并稀釋至標線，搖勻，作為混合雜質(zhì)對照品儲備溶液。臨用前，取混合雜質(zhì)對照品儲備液1 mL，置于25 mL 容量瓶中，用磷酸溶液稀釋至標線，配制成3種雜質(zhì)質(zhì)量濃度均為0.05 g/L 的混合雜質(zhì)對照品溶液。

樣品溶液：鹽酸拉貝洛爾質(zhì)量濃度為2 mg/mL。取鹽酸拉貝洛爾片20 片，研細混勻，精密稱取細粉適量(約相當于鹽酸拉貝洛爾50 mg)，用磷酸溶液溶解并稀釋，定容于25 mL 容量瓶中，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

靈敏度測試溶液：精密量取樣品溶液l mL，置于200 mL 容量瓶中，用磷酸溶液稀釋至標線，搖勻，再精密量取l mL，置于20 mL 容量瓶中，用磷酸溶液稀釋至標線，搖勻。

空白輔料溶液：模擬廠家處方，稱取空白輔料適量用磷酸溶液溶解配制相應濃度的溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；流動相：磷酸溶液為流動相A，乙腈-磷酸溶液(體積比為50∶50)為流動相B，流量為1.5 mL/min；磷酸溶液初始比例為100%，5～40 min 由100%逐漸減小到0%，40～45 min 由0%逐漸增加到100%；檢測波長：230 nm；柱溫：40 ℃；進樣體積：20 μL。

1.4 實驗方法

取混合雜質(zhì)對照品溶液、樣品溶液、空白輔料溶液和靈敏度測試溶液按1.3 色譜條件檢測，以外標法計算各雜質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 溶劑的選擇

鹽酸拉貝洛爾有兩個手性碳原子，以一對非對映異構(gòu)體的形式存在，有文獻報道采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細管電泳-質(zhì)譜法和毛細管電泳法對鹽酸拉貝洛爾非對映異構(gòu)體分離和測定[9-11]。BP2020 年版[5]亦采用衍生化氣相色譜法對非對映異構(gòu)體的比例進行了控制。試驗發(fā)現(xiàn)將鹽酸拉貝洛爾分別溶解在水、質(zhì)量分數(shù)為0.1%的磷酸溶液時，鹽酸拉貝洛爾的一對非對映異構(gòu)體合并為單個色譜峰出峰，分別溶解在乙醇和甲醇時，鹽酸拉貝洛爾的一對非對映異構(gòu)體分離成兩個色譜峰，且兩峰面積之和與溶劑為水時峰面積相當，DAD 檢測器檢測結(jié)果顯示，兩峰均歸屬于鹽酸拉貝洛爾。筆者選擇溶劑為0.1%磷酸溶液，以單個色譜峰進行考察。

2.1.2 檢測波長的選擇

分別配制質(zhì)量濃度均為50 μg/mL 的鹽酸拉貝洛爾、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B 和雜質(zhì)F 的單一對照品溶液，在200～900 nm 進行光譜掃描發(fā)現(xiàn)，鹽酸拉貝洛爾和雜質(zhì)A、雜質(zhì)B 和雜質(zhì)F 的最大吸收均在230 nm附近，故選擇檢測波長為230 nm。

2.2 色譜圖

分別取混合雜質(zhì)對照品溶液、空白輔料溶液、加標樣品溶液按照1.3 色譜條件檢測，色譜圖見圖1～圖3。

圖1 混合雜質(zhì)對照品溶液色譜圖

圖2 空白輔料溶液色譜圖

圖3 加標樣品溶液色譜圖

由圖1～圖3 可知，各雜質(zhì)與主峰均可以實現(xiàn)有效分離，空白輔料對檢測結(jié)果無干擾，表明該方法專屬性良好，可準確測定鹽酸拉貝洛爾片中雜質(zhì)的含量。

2.3 破壞及干擾試驗

按表1 中的試驗方法制備破壞性試驗溶液，按照1.3 色譜條件檢測，考察酸、堿、氧化、高溫、光照破壞后，各雜質(zhì)含量的變化情況，色譜圖如圖4～圖8。結(jié)果表明，強降解條件下，雜質(zhì)F 含量均未增加，推測雜質(zhì)F 為工藝雜質(zhì)，雜質(zhì)A 在酸、堿、氧化、高溫、光照破壞后均增加，雜質(zhì)B 在堿、氧化、高溫、光照破壞后均增加，提示應嚴格控制樣品儲藏和運輸條件，減少降解雜質(zhì)的產(chǎn)生。強降解條件下未產(chǎn)生其它干擾性雜質(zhì)。

表1 破壞實驗方法及結(jié)果

圖4 酸破壞下的樣品溶液色譜圖

圖5 堿破壞下的樣品溶液色譜圖

圖6 氧化破壞下的樣品溶液色譜圖

圖7 熱破壞下的樣品溶液色譜圖

圖8 光照破壞下的樣品溶液色譜圖

2.4 線性關系、檢出限和定量限

分別精密量取混合雜質(zhì)對照品溶液0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，用磷酸溶液稀釋至標線，得系列標準工作溶液。以各雜質(zhì)對照品質(zhì)量濃度為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數(shù)。

將雜質(zhì)對照品溶液進行適當稀釋后制得一系列不同濃度的溶液，以信噪比3 對應的質(zhì)量濃度作為檢出限，信噪比10 對應的質(zhì)量濃度作為定量限。

3 種雜質(zhì)線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限結(jié)果見表2。

表2 3 種雜質(zhì)線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 精密度試驗

取鹽酸拉貝洛爾片20 片，研細混勻，精密稱取細粉適量(約相當于鹽酸拉貝洛爾50 mg)，加入磷酸溶液溶解，移至25 mL 容量瓶中，精密加入混合雜質(zhì)對照品溶液1 mL，用磷酸溶液稀釋至標線。平行制備6 份，按1.3 色譜條件測定，結(jié)果列于表3。由表3 可知，3 種雜質(zhì)測定值的相對標準偏差均小于2.0%，表明該方法具有良好的精密度。

表3 精密度試驗結(jié)果

2.6 加標回收試驗

取鹽酸拉貝洛爾片細粉，精密稱取3 份(約相當與鹽酸拉貝洛爾50 mg)，置于25 mL 容量瓶中，分別加入磷酸溶液10 mL 溶解，再分別加入混合雜質(zhì)對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，用磷酸溶液稀釋至標線，搖勻。按1.3 色譜條件測定，計算加標回收率，結(jié)果見表4。由表4 可知，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C的平均回收率分別為98.0%、98.9%、98.0%，表明該法具有較高的準確度，可準確地測定鹽酸拉貝洛爾片中的雜質(zhì)含量。

表4 加標回收試驗結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗

取鹽酸拉貝洛爾片20 片，研細混勻，精密稱取細粉適量(約相當于鹽酸拉貝洛爾50 mg)，加入磷酸溶液溶解，精密加入混合對照品溶液1 mL，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8 h，按1.3 色譜條件進樣測定，考察不同時間下各雜質(zhì)的含量，結(jié)果表明各雜質(zhì)含量無明顯變化，測定值的相對標準偏差均小于1.5%，表明樣品溶液在室溫下放置8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 耐用性

取雜質(zhì)混合對照品溶液，對本方法進行耐用性的考察。在±0.2 mL/min 范圍內(nèi)變換流動相流量，在±5 ℃范圍內(nèi)改變初始柱溫，在±5%范圍內(nèi)改變流動相A 即磷酸溶液的體積分數(shù)，以及采用不同色譜柱(AgelaVenusil MP C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm) 和Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)進行測定，精密量取空白溶液、雜質(zhì)混合對照品溶液和樣品溶液，分別注入液相色譜儀，分析并記錄色譜圖。以標準曲線法計算鹽酸拉貝洛爾片中的有關物質(zhì)含量。結(jié)果顯示，在較小范圍改變測定條件，各雜質(zhì)峰含量變化不大，表明該方法具有較好的耐用性。

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜方法同時測定鹽酸拉貝洛爾片中的雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)F，該方法具有較好的重復性，操作簡單。該方法不受溶劑等因素影響，簡便快速，可用于更好地控制鹽酸拉貝洛爾片的質(zhì)量。