吳文濤，田振，陳錦鴻，婁朝暉

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨五科，河南 鄭州 450000)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是一種起源于間充質(zhì)的惡性腫瘤，起源于成骨細(xì)胞系，其特征是產(chǎn)生類骨樣基質(zhì)[1-2]。OS主要發(fā)生在承重骨的干骺端區(qū)域，最常見的是股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端和肱骨近端[3]。在青少年中，OS發(fā)展的高峰期在10～20歲，與骨骼生長加速相關(guān)的快速骨轉(zhuǎn)換相關(guān)[4]。在生物學(xué)上，OS表現(xiàn)為高級別肉瘤，具有侵襲性的溶骨特性和強(qiáng)烈的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移傾向。能夠擾亂局部骨骼微環(huán)境，通過血液途徑傳播到遠(yuǎn)處的內(nèi)臟器官，最常見的是肺實質(zhì)[5-6]。少數(shù)情況下，OS可能會通過淋巴引流轉(zhuǎn)移到區(qū)域淋巴結(jié)[7]。靶向、免疫治療作為腫瘤治療的新方法，近年來得到了很大的發(fā)展，但骨肉瘤患者的總體預(yù)后依然沒有明顯改善，晚期患者的5 a生存率仍然處于較低水平。

目前，原發(fā)腫瘤和肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤動物模型仍不能全面準(zhǔn)確地概括人類的自然疾病過程。但有助于增進(jìn)我們對骨肉瘤生物學(xué)的理解，并將有助于發(fā)現(xiàn)疾病的發(fā)病機(jī)制和確定新的治療策略。將小鼠(同種移植)或人(異種移植)癌細(xì)胞懸浮液注射到原位是誘發(fā)小鼠骨肉瘤最常用的方法[8-9]。大多數(shù)人骨肉瘤細(xì)胞系不會致瘤，在裸鼠體內(nèi)也沒有轉(zhuǎn)移能力[10]。最近，有研究將患者活檢獲得的腫瘤材料植入免疫缺陷動物[11-12]，以此來模仿人類骨肉瘤成瘤及轉(zhuǎn)移過程，并成功獲得了骨肉瘤動物模型。這種患者來源的異種移植物形成的小鼠模型，優(yōu)點(diǎn)是有可能通過保留原始的腫瘤來擴(kuò)大腫瘤組織，保持與原腫瘤細(xì)胞的相似性。但這種方式獲得的骨肉瘤動物模型的可靠性和可重復(fù)性有待進(jìn)一步驗證，為此本研究開展了下面的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物24只，雌性，nu/nu BALB/cA Bom，4～6周齡裸鼠，購自河南省實驗動物中心，動物級別為SPF級實驗動物，裸鼠在恒溫[(25±0.5)℃]、恒濕(50%)的無特定病原體條件下保存。在實驗過程中，統(tǒng)一飼養(yǎng)所有實驗動物，提供相同且標(biāo)準(zhǔn)化的飲用水和動物飼料，并且根據(jù)醫(yī)學(xué)倫理標(biāo)準(zhǔn)，處理實驗過程中的所有動物。

1.2 人骨肉瘤原發(fā)腫瘤從手術(shù)中獲得了1名12歲骨肉瘤女性患者的原發(fā)腫瘤，原發(fā)腫瘤位于脛骨近端，大小約4.0 cm×3.5 cm×3.0 cm。術(shù)前已經(jīng)進(jìn)行了穿刺活檢，病理學(xué)上已經(jīng)診斷為高級別骨肉瘤，以確保獲得的腫瘤組織是骨肉瘤組織。原發(fā)腫瘤是成軟骨細(xì)胞型的骨肉瘤，間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)多樣，染色質(zhì)密度不同。原發(fā)腫瘤侵及骨骼，穿透皮質(zhì)，周圍骨骼肌、脂肪和結(jié)締組織也可見腫瘤浸潤。

1.3 異種皮下種植將人骨肉瘤組織切碎，并選擇腫瘤中有活力的部分。在局部麻醉下，常規(guī)皮膚消毒，分別在2只裸鼠雙側(cè)前腿根部前上方的背部用眼科剪剪開皮膚，約0.5 cm大小，鑷子擴(kuò)開皮下通道約2 mm，將腫瘤組織塊置于皮下，手術(shù)縫合。術(shù)后立即送至風(fēng)凈化籠具飼養(yǎng)，每周觀察接種的小鼠的一般外觀，并使用滑動卡尺測量腫瘤的三維大小。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到大約15 mm時，處死攜帶腫瘤的裸鼠。在無菌條件下，留取裸鼠皮下移植腫瘤物按同樣方法進(jìn)行連續(xù)傳代3次[13-14]，各代腫瘤體內(nèi)增殖穩(wěn)定，致瘤率均為100%，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)符合人骨肉瘤的特征。

1.4 成瘤組織塊移植采用第3代異種皮下移植物進(jìn)行原位移植。在無菌條件下，將可存活的腫瘤組織在磷酸鹽緩沖鹽水中剪切成直徑約0.5 mm的碎片備用。麻醉裸鼠，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇清洗裸鼠左腿，然后在靠近裸鼠膝關(guān)節(jié)前下方處切開左小腿，暴露脛骨前結(jié)節(jié)內(nèi)側(cè)近端皮質(zhì)，用1 mL一次性無菌注射器針頭傾斜45°沿脛骨遠(yuǎn)端方向插入鉆孔，當(dāng)出現(xiàn)落空感時即可，在局部造成直徑約2.0 mm的骨缺損，抽出少量的骨髓液減小髓腔壓力，將制備好的碎塊置入脛骨髓腔內(nèi)，骨蠟封閉鉆孔后逐層縫合，切口用紅霉素眼膏涂抹。手術(shù)后在恒溫[(26～27)℃]、恒濕(45%～50%)半屏障系統(tǒng)環(huán)境中飼養(yǎng)，每日觀察手術(shù)切口變化，直至完全愈合。

1.5 記錄裸鼠的一般情況造模后，每天喂食前觀察它們的行為特征等基本情況，每隔3 d記錄1次。每周末對所有動物稱重1次，并進(jìn)行觀察和記錄，每次均在喂食前進(jìn)行稱量。在進(jìn)行裸鼠原位移植后每隔1周測量腫瘤相互垂直的兩直徑D1和D2，按以下公式計算體積(V)：

V=(4/3)π[1/4(D1+D2)]3。

1.6 評價骨內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的形成每天檢查裸鼠的一般外觀和局部脛骨腫瘤的生長情況。于移植后4周麻醉后頸椎脫位處死。尸檢時切除左側(cè)脛骨和股骨遠(yuǎn)端，將后肢小腿進(jìn)行正、側(cè)位X射線檢查。

1.7 腫瘤的病理學(xué)檢測將組織固定在體積分?jǐn)?shù)為4%的甲醛水溶液中，脛骨和股骨脫鈣，所有組織常規(guī)石蠟包埋。組織學(xué)檢查：切片4～6 mm，蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.8 免疫組化檢查查閱初始人骨肉瘤手術(shù)標(biāo)本病理報告并選擇報告中的免疫組織化學(xué)指標(biāo)(p53、Ki67、CD117、Bcl-2、Bcl-4)，測定裸鼠脛骨移植瘤免疫組織化學(xué)指標(biāo)的表達(dá)情況，以確定移植瘤是否保留了原始腫瘤的生物學(xué)特性。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物觀察分析實驗操作過程中裸鼠未發(fā)生脛骨骨折，2只裸鼠術(shù)后5 d內(nèi)死亡，考慮感染，總體而言，隨著裸鼠造模手術(shù)切口愈合后，活動量逐漸下降，精神狀態(tài)慢慢惡化，覓食習(xí)慣逐步改變，裸鼠質(zhì)量隨著天數(shù)的增加逐漸增加(P<0.05)。移植后1周的裸鼠均未出現(xiàn)肉眼可見的脛骨腫瘤，2周后腫瘤體積開始隨著天數(shù)的增加而逐漸增加(P<0.05)。移植4周后存活的裸鼠尸檢發(fā)現(xiàn)了肉眼可見的脛骨腫瘤。見表1。

表1 移植后腫瘤生長及成瘤情況

2.2 影像學(xué)表現(xiàn)X線顯示，脛骨腫瘤具有人類原發(fā)骨肉瘤的特征，包括中央性骨溶解、毛刺狀新骨形成和向周圍軟組織延伸。見圖1。

圖1 移植后3周X線片可見干骺端骨質(zhì)破壞

2.3 病理學(xué)表現(xiàn)裸鼠腫瘤具有明顯的包膜，質(zhì)地比較堅硬，表面存在結(jié)節(jié)，血管分布廣泛。顯微鏡檢查顯示腫瘤在髓內(nèi)生長至脛骨干骺端。2只裸鼠移植腫瘤穿透皮質(zhì)并滲入周圍的軟組織，但骨骺線始終保持完好。內(nèi)部生長的腫瘤在結(jié)構(gòu)上與供者的腫瘤相似，可見低鈣化的惡性類骨質(zhì)，間質(zhì)細(xì)胞高度多態(tài)，可見有絲分裂像，少量軟骨瘤區(qū)，間質(zhì)細(xì)胞小而深染。在異種移植物中觀察到相當(dāng)豐富的血管供應(yīng)，但無毛細(xì)血管擴(kuò)張區(qū)。裸鼠身上形成的移植瘤免疫組化結(jié)果顯示p53陽性、Ki67陽性、CD117陰性、Bcl-2陽性、Bcl-4陽性，與原發(fā)于患者的腫瘤相同，證明移植瘤很好地保留了原發(fā)腫瘤的生物學(xué)性狀。

A為人骨肉瘤病理切片；B為裸鼠原位移植骨肉瘤切片。

從左到右依次為p53陽性、Ki67陽性、CD117陰性、Bcl-2陽性、Bcl-4陽性。

3 討論

骨肉瘤是最常見的原發(fā)骨腫瘤，治療的策略是基于新輔助化療、延遲切除和根據(jù)手術(shù)中切除的腫瘤組織評估的組織學(xué)進(jìn)行輔助化療[15]。盡管在過去的25年，手術(shù)技術(shù)有了很大的進(jìn)步，化療方案也有了不同的發(fā)展，但5 a后的存活率仍保持在55%～70%[16-17]。為了繼續(xù)提高對這種疾病的認(rèn)識和測試新的治療方法，需要在時間、生理和組織水平上準(zhǔn)確再現(xiàn)人類病理的動物模型。

骨肉瘤動物模型可以分為自發(fā)型、誘導(dǎo)型、腫瘤移植和基因工程，最常用的仍是腫瘤移植造模，其他模型由于存在成瘤時間長、發(fā)病率低、穩(wěn)定性差、均一性差等缺點(diǎn)而受到限制[18]。腫瘤移植通過將腫瘤組織塊或細(xì)胞株移植到動物模型體內(nèi)，形成與原發(fā)腫瘤相同的腫瘤，再把腫瘤移植到下一代，從而構(gòu)建動物模型[19-20]?，F(xiàn)在多用于腫瘤成瘤、治療、浸潤、轉(zhuǎn)移等方面的實驗研究。然而已建立的細(xì)胞系可能代表不了人類腫瘤的遺傳異質(zhì)性，無法使用真正的原始細(xì)胞建立真正的原位模型[21]。來源于患者的骨肉瘤動物模型優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)胞系-異種移植模型，保持了與原代腫瘤更多的相似性[22-23]。

本研究結(jié)果表明，人骨肉瘤裸鼠脛骨移植瘤能持續(xù)、快速局部生長，侵襲周圍組織，并能自發(fā)轉(zhuǎn)移到肺，與Crnalic 等[24]的研究結(jié)果相似，然而Kimura等[10]認(rèn)為大多數(shù)人骨肉瘤細(xì)胞系不會致瘤，在裸鼠體內(nèi)也無轉(zhuǎn)移能力。這可能是由于將人骨肉瘤組織在裸鼠皮下進(jìn)行連續(xù)傳代過程中進(jìn)行了更具侵襲性的克隆，更適應(yīng)在裸鼠體內(nèi)生長，逐漸增加了異種移植的成瘤率。目前大多數(shù)研究主張使用低傳代次數(shù)(<10次)的人源腫瘤異種移植模型來保留腫瘤的遺傳完整性[14]。本研究采用第3代異種皮下移植物進(jìn)行原位移植獲得的腫瘤組織不僅與人骨肉瘤原始組織相似，而且保留了原始腫瘤的特征。

通過組織塊移植法，將腫瘤碎片置入裸鼠的脛骨髓腔內(nèi)，能夠使其獲得類似于人類腫瘤生長的微環(huán)境和多種促進(jìn)腫瘤生長的內(nèi)源性生長因子，在相對較短的時間內(nèi)腫瘤就在局部生長并產(chǎn)生了自發(fā)轉(zhuǎn)移。相較于細(xì)胞懸浮液法原位移植，不僅避免了打破細(xì)胞-細(xì)胞之間的聯(lián)系和破壞人類腫瘤組織的原始結(jié)構(gòu)導(dǎo)致原發(fā)腫瘤的性質(zhì)和生物學(xué)行為的改變[25]，而且不會產(chǎn)生骨內(nèi)壓力，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散到周圍組織和循環(huán)中。通過這種方式，可以更好地模仿腫瘤體內(nèi)自發(fā)轉(zhuǎn)移的過程，如局部腫瘤的生長和侵襲。這也表明了骨環(huán)境的生長刺激和腫瘤細(xì)胞間的相互作用對腫瘤的攝取率和局部生長以及骨肉瘤的轉(zhuǎn)移都是十分重要的。

本文通過腫瘤塊移植法建立了骨肉瘤動物模型，成功構(gòu)建了人源性骨肉瘤動物模型，進(jìn)一步驗證了這種造模方式的可行性，為骨肉瘤的進(jìn)一步研究、治療等奠定了基礎(chǔ)。