邱煜焱 楊 旭 茍文軍 劉思源 康海軍 劉靈琳

視網(wǎng)膜病變是2型糖尿病(T2DM)的常見并發(fā)癥之一，發(fā)生率約為30%[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與免疫炎癥和氧化應(yīng)激損傷、線粒體損傷、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙等有關(guān)[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起到重要作用。研究表明，lncRNA在DR發(fā)生和發(fā)展中有重要意義[3]。血清lncRNA表達(dá)異常在預(yù)測DR發(fā)生中的價值也逐漸受到重視。如許瑤等[4]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA非活性特異性轉(zhuǎn)錄本在DR患者血清中表達(dá)水平下降，有可能成為預(yù)測DR的良好分子標(biāo)志物。人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)最早在肺癌中被報道[5]，后來逐漸發(fā)現(xiàn)MALAT1與炎癥、氧化應(yīng)激、血管生成和細(xì)胞凋亡等有關(guān)，也被證實(shí)在糖尿病并發(fā)癥(心肌病和腎病)中起到重要作用[6]。在體外研究中發(fā)現(xiàn)，高糖處理人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞后MALAT1表達(dá)水平升高，敲低MALAT1后細(xì)胞增殖、遷移和血管通透性明顯受到抑制[7]。既往有關(guān)DR患者外周血MALAT1的表達(dá)及意義的報道較少。本研究分析T2DM患者血清lncRNA MALAT1與DR的關(guān)系，旨在為DR的早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2019年1月至2021年6月本院184例(368眼)T2DM患者的臨床資料，其中T2DM無并發(fā)癥患者54例(非DR組)，T2DM合并非增生型DR患者62例(非增生組)，T2DM合并增生型DR患者68例(增生組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[8]；(2)年齡>18歲；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)T1DM患者；(2)嚴(yán)重的心、肝、腎功能障礙；(3)急、慢性感染；(4)免疫和代謝疾??；(5)腫瘤；(6)青光眼、白內(nèi)障、屈光改變等眼部疾病；(7)妊娠期或哺乳期婦女。本研究已經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料采集收集患者性別、年齡、體重指數(shù)、糖尿病病程、高血壓病史、高脂血癥病史、吸煙和飲酒史等一般資料。用全自動生化檢測儀檢測患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血肌酐(Scr)、血尿酸(SUA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測患者白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測患者空腹胰島素(Fins)，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=(FPG×Fins)/22.5。用離子交換高效液相色譜法檢測患者糖化血紅蛋白(HbA1c)。

1.2.2 眼底檢查所有患者入院時均接受眼底檢查，用眼底檢查儀對每眼各采集6個視野的45°眼底像。非增生型DR：僅見到微動脈瘤或者4個象限內(nèi)有2處以上視網(wǎng)膜內(nèi)出血，或者2個以上象限有視網(wǎng)膜靜脈串珠樣改變，或者1個以上象限有明顯視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常。增生型DR：有明顯新生血管形成，視網(wǎng)膜前出血或者玻璃體積血[9]。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測患者血清MALAT1表達(dá)水平所有患者均于入院次日抽取空腹肘靜脈血，4 ℃、3000 r·min-1條件下離心15 min，留取血清。用Trizol法提取總RNA。將2 μg總RNA加入20 μL三氯甲烷中，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。引物序列：MALAT1正向引物序列為5’-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3’；反向引物序列為5’-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3’；β-actin正向引物序列為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’；反向引物序列為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計算患者血清MALAT1相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性用Pearson分析；二元Logistic回歸分析T2DM患者發(fā)生DR的影響因素；采用受試者工作特征曲線(ROC)分析MALAT1預(yù)測DR的價值，計算曲線下面積(AUC)、靈敏度和特異度。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 三組患者臨床資料比較增生組、非增生組、非DR組患者年齡、病程、LDL-C、HbA1c、HOMA-IR、IL-6、TNF-α和MALAT1差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.001);增生組和非增生組患者以上各指標(biāo)均高于非DR組(均為P<0.05)，且增生組均高于非增生組(均為P<0.05)。其余資料三組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 三組患者臨床資料比較

2.2 MALAT1與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析MALAT1與患者病程、LDL-C、HbA1c、HOMA-IR、IL-6、TNF-α均呈正相關(guān)(均為P<0.05)，但是與ALT、AST、Scr、SUA、TC、TG、HDL-C、FPG均無相關(guān)性(均為P>0.05)(表2)。

表2 MALAT1與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3 T2DM患者發(fā)生DR的影響因素分析以是否發(fā)生DR為因變量，以表1中存在統(tǒng)計學(xué)差異的變量(年齡、病程、LDL-C、HbA1c、HOMA-IR、IL-6、TNF-α和MALAT1)為自變量，進(jìn)行二元Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，年齡、病程、LDL-C、HbA1c、HOMA-IR、IL-6、TNF-α和MALAT1是T2DM患者發(fā)生DR的獨(dú)立影響因素(均為P<0.05)(表3)。

表3 T2DM患者發(fā)生DR的影響因素分析

2.4 ROC曲線分析血液指標(biāo)預(yù)測T2DM患者發(fā)生DR的價值MALAT1預(yù)測T2DM患者發(fā)生DR的AUC為0.843，高于LDL-C(0.464)、HbA1c(0.606)、HOMA-IR(0.601)、IL-6(0.663)、TNF-α(0.694)。MALAT1預(yù)測T2DM患者發(fā)生DR的靈敏度和特異度分別為89.34%和71.55%(表4)。說明MALAT1預(yù)測T2DM患者發(fā)生DR的價值較高。

表4 血液指標(biāo)預(yù)測T2DM患者發(fā)生DR的價值

3 討論

lncRNA在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起重要作用，在血液和尿液等體液中表達(dá)相對穩(wěn)定[10]。研究顯示，糖尿病及相關(guān)微血管并發(fā)癥中廣泛存在lncRNA表達(dá)異常，lncRNA可能成為DR的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[11]。

MALAT1最初是在非小細(xì)胞肺癌中被發(fā)現(xiàn)的，隨后也在心臟病和糖尿病中被報道。MALAT1位于人染色體11q13.1上，該基因產(chǎn)生一個高度保守的非編碼轉(zhuǎn)錄本，其長度約8000個核苷酸。MALAT1與胰島素抵抗和糖脂代謝關(guān)系密切，參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展[12]。既往研究顯示，MALAT1與糖尿病微血管并發(fā)癥有關(guān)[13]。近年來研究表明， MALAT1可能通過p38分裂原激活蛋白酶信號通路[14]、miRNA-125b/血管內(nèi)皮鈣黏蛋白信號通路[7]、炎癥信號通路[15]等參與DR的發(fā)生發(fā)展。然而， DR患者外周血MALAT1的表達(dá)及意義既往鮮有報道。

本研究結(jié)果表明，增生組和非增生組患者血清MALAT1均高于非DR組，且增生組患者高于非增生組，提示MALAT1可能參與DR的發(fā)生和病情進(jìn)展。免疫炎癥紊亂是DR發(fā)生發(fā)展的重要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，DR患者血清和玻璃體內(nèi)炎癥因子IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和TNF-α表達(dá)水平均升高[16]。本研究結(jié)果表明，MALAT1與IL-6(r=0.280)、TNF-α(r=0.330)均呈正相關(guān)(均為P<0.001)。提示MALAT1可能通過免疫炎癥損傷影響DR進(jìn)展。本研究中多因素分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，MALAT1(OR=3.786)是T2DM患者發(fā)生DR的獨(dú)立影響因素。既往研究表明，MALAT1可能成為糖尿病相關(guān)并發(fā)癥(心血管病、腎病、胃病)的診斷和治療靶點(diǎn)[13]。本研究用ROC曲線分析了MALAT1對DR的預(yù)測價值，結(jié)果顯示，MALAT1預(yù)測T2DM患者發(fā)生DR的AUC為0.843，均高于LDL-C(0.464)、HbA1c(0.606)、HOMA-IR(0.601)、IL-6(0.663)、TNF-α(0.694)，MALAT1預(yù)測T2DM患者發(fā)生DR的靈敏度和特異度分別為89.34%和71.55%，結(jié)果提示預(yù)測價值較高。

綜上所述，T2DM患者發(fā)生DR時血清MALAT1表達(dá)水平升高，并且與糖脂代謝、炎癥指標(biāo)及病情進(jìn)展相關(guān)。MALAT1可能是預(yù)測T2DM發(fā)生DR的生物學(xué)指標(biāo)。未來需要繼續(xù)分析MALAT1的臨床意義及生物學(xué)機(jī)制，以期開發(fā)潛在的診斷和治療靶點(diǎn)。