韓昌婧 徐 麗 段雪娟 艾 欣
糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥之一,它可能導(dǎo)致患者嚴重的視力障礙甚至失明[1]。近年來,隨著糖尿病的發(fā)病率逐漸增加,DR成了威脅中青年人群視力的常見因素[2]。DR的發(fā)病機制相當(dāng)復(fù)雜,與視網(wǎng)膜炎癥、視網(wǎng)膜血管滲透性增加以及血-視網(wǎng)膜屏障破壞有關(guān)。這些過程會引起視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞無序地增殖和遷移以及毛細血管形成,最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管形成[3-5]。KIF11是一種紡錘體驅(qū)動蛋白,在紡錘體雙極性的形成和維持中發(fā)揮重要作用[6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),KIF11在多種腫瘤中過度表達,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。下調(diào)KIF11可抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[9]。Shao等[10]分析GSE60436數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),KIF11在增生型DR視網(wǎng)膜組織中表達上調(diào),且可能與血管生成和視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的增殖有關(guān)。但是KIF11在DR中的作用還未見報道。因此,本研究擬通過高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(HRMECs)損傷建立DR模型,分析KIF11在DR中的作用和機制。
1.1 材料HRMECs(中科院細胞庫),DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司),胎牛血清(美國Hyclone公司),LiCl、總RNA提取試劑盒、通用逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(M-MLV)和Real-time PCR試劑盒(北京索萊寶公司),Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司),CCK-8試劑盒(美國MedChemExpress公司),Transwell小室(美國BD公司),RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司),抗KIF11、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、β-catenin、cyclin D1和c-Myc兔單克隆抗體(美國Cell signaling technology公司),抗VEGF小鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),抗GAPDH鼠單克隆抗體、HRP標記的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG二抗(北京康為試劑公司)。KIF11 siRNA序列(si-KIF11)、對照序列(si-NC)和Real-time PCR引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成,ABI 7500 Real-time PCR儀和NanoDrop 2000C超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司),Tanon 4600 全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組將HRMECs培養(yǎng)在含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃,含體積分數(shù)5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。正常培養(yǎng)24 h后,將細胞隨機分成4組:正常組、高糖組、高糖+si-NC組、高糖+si-KIF11組。正常組細胞在含5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng);高糖組細胞在含30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng);高糖+si-NC組和高糖+si-KIF11組先使用Lipofectamine 3000將100 nmol·L-1si-NC或100 nmol·L-1si-KIF11分別轉(zhuǎn)染至細胞中,6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,然后再給予含30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。
另外,將正常培養(yǎng)的HRMECs隨機分成高糖組、高糖+si-KIF11組、高糖+si-KIF11+NC組和高糖+si-KIF11+LiCl組來驗證KIF11是否通過Wnt/β-catenin通路發(fā)揮作用。高糖組和高糖+si-KIF11組細胞處理方法同前。高糖+si-KIF11+NC組和高糖+si-KIF11+LiCl組在轉(zhuǎn)染si-KIF11后分別加入20 mmol·L-1NaCl或20 mmol·L-1LiCl孵育2 h后給予含30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。
1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力將HRMECs按照每孔1×103個接種到96孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,分組處理后,每孔中加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h,用酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度。
1.2.3 Transwell實驗檢測細胞遷移將分組處理后的HRMECs用胰蛋白酶消化后,無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成濃度為105個·mL-1的細胞懸液。取200 μL細胞懸液加入到Transwell上室,下室加入含不同濃度的葡萄糖及體積分數(shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)基。在細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后,用棉簽輕輕地將上層未遷移的細胞擦掉,下層PBS清洗后,40 g·L-1多聚甲醛固定30 min,結(jié)晶紫染色20 min,然后于顯微鏡下觀察拍照并對細胞進行計數(shù)。實驗重復(fù)3次。
1.2.4 Real-time PCR檢測細胞分組處理后,棄培養(yǎng)基,冰冷的PBS清洗細胞3次,用總RNA提取試劑盒提取細胞的總RNA,將總RNA沉淀溶解到無RNA酶的水中。然后根據(jù)試劑盒說明書配制20 μL的反應(yīng)體系,將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取1 μL cDNA根據(jù)Real-time PCR試劑盒說明書操作,進行PCR擴增。KIF11、VEGF和HIF-1α mRNA水平根據(jù)公式2-△△Ct計算,以GAPDH為內(nèi)參,引物序列見表1。實驗重復(fù)3次。
1.2.5 Western blot檢測細胞分組處理后,加入100 μL RIPA裂解液裂解30 min,4 ℃條件下15 000 r·min-1離心10 min,吸取含總蛋白的上清液,用BCA試劑盒測定蛋白濃度后,每個樣品取30 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后,用50 g·L-1脫脂奶粉對膜進行封閉,之后加入提前稀釋好的一抗KIF11(11000)、HIF-1α(11000)、β-catenin(11000)、cyclin D1(1800)、c-Myc(1800)、VEGF(1600)和GAPDH (12000)在4 ℃過夜孵育。用TBST充分洗膜3次,加入二抗(15000)室溫孵育1 h。用ECL發(fā)光液對蛋白條帶進行顯色,并用ImageJ軟件分析各個蛋白條帶的吸光度。以GAPDH為內(nèi)參,計算目的蛋白的表達量。實驗重復(fù)3次。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料用均數(shù)±標準差表示。多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析,并用LSD-t方法進行兩兩比較。檢驗水準:α=0.05。
2.1 KIF11在高糖誘導(dǎo)的HRMECs中表達增加Real-time PCR和Western blot檢測KIF11 mRNA和蛋白表達,結(jié)果見圖1。高糖組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達均較正常組顯著升高(均為P<0.05),高糖+si-KIF11組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達均低于高糖組(均為P<0.05),而高糖+si-NC組與高糖組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。
圖1 各組HRMECs的KIF11 mRNA和蛋白表達 A:Real-time PCR檢測結(jié)果;B:Western blot檢測結(jié)果;C:KIF11蛋白相對表達量。1:正常組;2:高糖組;3:高糖+si-NC組;4:高糖+si-KIF11組。與正常組相比,*P<0.05;與高糖組相比,#P<0.05。
2.2 降低KIF11表達對高糖誘導(dǎo)的HRMECs增殖的影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示,正常組、高糖組、高糖+si-NC組和高糖+si-KIF11組HMRECs細胞活力分別為100.0%±4.0%、149.3%±6.5%、148.4%±8.5%、110.0%±5.6%。兩兩比較結(jié)果顯示,高糖組HRMECs細胞活力較正常組增加(P<0.05),高糖+si-KIF11組HRMECs細胞活力低于高糖組(P<0.05),而高糖+si-NC組與高糖組HRMECs細胞活力相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
2.3 降低KIF11表達對高糖誘導(dǎo)的HRMECs遷移的影響Transwell實驗檢測結(jié)果顯示,正常組、高糖組、高糖+si-NC組和高糖+si-KIF11組遷移細胞數(shù)分別為(48.3±4.7)個、(103.4±8.1)個、(100.3±9.1)個、(60.0±6.2)個。兩兩比較結(jié)果顯示,高糖組HRMECs遷移細胞數(shù)較正常組增多(P<0.05),高糖+si-KIF11組HRMECs遷移細胞數(shù)低于高糖組(P<0.05),而高糖+si-NC組與高糖組HRMECs遷移細胞數(shù)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。
圖2 各組HRMECs遷移情況 A:正常組;B:高糖組;C:高糖+si-NC組;D:高糖+si-KIF11組。
2.4 降低KIF11表達對高糖誘導(dǎo)的HRMECs血管生成相關(guān)因子表達的影響Real-time PCR和Western blot檢測血管生成相關(guān)因子VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白表達,結(jié)果見圖3。與正常組相比,高糖組HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白相對表達量均顯著升高(均為P<0.05);高糖+si-KIF11組HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白相對表達量均低于高糖組(均為P<0.05),而高糖+si-NC組與高糖組相比,HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。
圖3 各組HRMECs的VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白表達 A:VEGF mRNA相對表達量;B:HIF-1α mRNA相對表達量;C:Western blot檢測結(jié)果;D:VEGF蛋白相對表達量;E:HIF-1α蛋白相對表達量。1:正常組;2:高糖組;3:高糖+si-NC組;4:高糖+si-KIF11組。與正常組相比,*P<0.05;與高糖組相比,#P<0.05。
2.5 降低KIF11表達對Wnt/β-catenin通路的影響Western blot檢測Wnt/β-catenin通路的活化情況,結(jié)果見圖4。與正常組相比,高糖組HRMECs的β-catenin及下游分子cyclin D1和c-Myc蛋白相對表達量均顯著升高(均為P<0.05);高糖+si-KIF11組HRMECs的β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白相對表達量均低于高糖組(均為P<0.05),而高糖+si-NC組與高糖組相比,HRMECs的β-catenin、cyclin D1和c-Myc 蛋白相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。
圖4 各組HRMECs的β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白表達 A:Western blot檢測結(jié)果;B:β-catenin蛋白相對表達量;C:cyclin D1蛋白相對表達量;D:c-Myc蛋白相對表達量。1:正常組;2:高糖組;3:高糖+si-NC組;4:高糖+si-KIF11組。與正常組相比,*P<0.05;與高糖組相比,#P<0.05。
2.6 Wnt/β-catenin通路激活劑可逆轉(zhuǎn)KIF11下調(diào)對高糖誘導(dǎo)的HRMECs損傷的影響CCK-8檢測和Transwell檢測結(jié)果顯示,高糖組、高糖+si-KIF11組、高糖+si-KIF11+NC組和高糖+si-KIF11+LiCl組HRMECs細胞活力分別為100.0%±5.3%、65.1%±5.6%、66.7%±6.4%、90.3%±5.7%,遷移細胞數(shù)分別為(106.0±7.5)個、(59.7±4.6)個、(57.7±7.0)個、(94.6±8.4)個。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,高糖+si-KIF11+LiCl組細胞活力和遷移細胞數(shù)均較高糖+si-KIF11組增加(均為P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示,與高糖+si-KIF11組相比,高糖+si-KIF11+LiCl組HRMECs的VEGF和HIF-1α蛋白相對表達量均顯著升高(均為P<0.05)。高糖+si-KIF11+NC組與高糖+si-KIF11組相比,HRMECs的細胞活力、遷移細胞數(shù)、VEGF和HIF-1α蛋白相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)(圖5)。
圖5 LiCl對各組HRMECs的遷移及VEGF、HIF-1α蛋白表達的影響 A:Transwell檢測細胞遷移;B:Western blot檢測結(jié)果;C:VEGF蛋白相對表達量;D:HIF-1α蛋白相對表達量。2:高糖組;4:高糖+si-KIF11組;5:高糖+si-KIF11+NC組;6:高糖+si-KIF11+LiCl組。與高糖組相比,*P<0.05;與高糖+si-KIF11組相比,#P<0.05。
DR是與糖尿病相關(guān)的慢性、嚴重的眼部并發(fā)癥,并且DR患者出現(xiàn)糖尿病相關(guān)的其他微血管和大血管并發(fā)癥的風(fēng)險增加[11]。高血糖與DR的病理變化密切相關(guān),可誘導(dǎo)血管新生、炎癥、氧化應(yīng)激和細胞增殖[11]。VEGF是DR血管病理變化中一個重要的血管生成因子[12]。VEGF在多種視網(wǎng)膜細胞中表達,如視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞、Müller細胞、星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)節(jié)細胞[13]。在DR發(fā)病過程中,視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞在血管形成中反應(yīng)最為迅速[14]。過表達VEGF是引起血管新生和血管滲漏的主要因素。VEGF可通過自分泌信號促進人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成,在視網(wǎng)膜中也可通過旁分泌信號調(diào)節(jié)血管生成過程中與其他細胞的合作[15]。HIF-1α是調(diào)控VEGF表達的一個重要轉(zhuǎn)錄因子,在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中可被高糖誘導(dǎo)表達[16]。因此,本研究通過體外高糖誘導(dǎo)HRMECs損傷來探究DR的分子機制。本研究中,經(jīng)高糖處理后HRMECs的增殖、遷移能力增加,且血管生成相關(guān)因子VEGF和HIF-1α表達上調(diào),這表明體外模型建立成功。
KIF11基因位于10q24.1,其結(jié)構(gòu)在多個物種間具有保守性,主要由運動結(jié)構(gòu)域、內(nèi)部莖結(jié)構(gòu)域和尾部結(jié)構(gòu)域組成。研究證實,KIF11是調(diào)控細胞有絲分裂的一個重要分子[7]。近年來的研究顯示,KIF11在多種腫瘤細胞中表達增加,參與了腫瘤的發(fā)展進程[7-8]。KIF11與腫瘤發(fā)展中血管生成也存在一定聯(lián)系,如Luo等[17]等研究顯示,KIF11在腎母細胞瘤中表達升高;KIF11過表達不僅與瘤細胞的增殖有關(guān),還與VEGF表達和瘤內(nèi)微血管密度有關(guān)[17]。Exertier等[18]研究發(fā)現(xiàn),KIF11抑制劑可減弱腫瘤細胞增殖,損傷內(nèi)皮細胞血管生成能力。KIF11在增生型DR組織中表達上調(diào),且其表達量與血管生成和視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖相關(guān)基因表達有關(guān)[10]。因此,本研究通過體外實驗探究了KIF11在DR中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),KIF11在高糖誘導(dǎo)的HRMECs中表達上調(diào),這與其在增生型DR組織中的表達趨勢一致[10]。下調(diào)KIF11表達顯著降低了高糖誘導(dǎo)的HRMECs的增殖、遷移以及VEGF和HIF-1α表達,這表明下調(diào)KIF11可抑制高糖誘導(dǎo)的HRMECs損傷,這主要與其血管生成被抑制有關(guān)。
本研究進一步探究了KIF11可能的作用機制。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路在胚胎生成和成體組織穩(wěn)態(tài)中是一個進化保守的調(diào)節(jié)通路[19-20]。它對于包括眼在內(nèi)的多種器官的血管形態(tài)形成至關(guān)重要。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn),Wnt/β-catenin信號通路異常能引起多種眼科疾病。Wnt/β-catenin通路的過度活化與DR中的視網(wǎng)膜炎癥和血管生成有關(guān)[22]。Pei等[23]研究表明,KIF11可通過激活Wnt/β-catenin通路增加乳腺癌細胞的自我更新。因此,本研究進一步探究了KIF11是否通過Wnt/β-catenin通路在高糖誘導(dǎo)的HRMECs損傷中發(fā)揮作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)KIF11顯著降低了高糖誘導(dǎo)的β-catenin及下游分子cyclin D1和c-Myc蛋白水平。LiCl通過抑制GSK-3β穩(wěn)定游離的細胞質(zhì)β-catenin蛋白,從而激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路[22]。本研究使用LiCl進一步驗證發(fā)現(xiàn),與高糖+si-KIF11組相比,高糖+si-KIF11+LiCl組HRMECs細胞活力和遷移細胞數(shù)均顯著增加,且VEGF和HIF-1α蛋白表達水平均顯著上調(diào)。這表明KIF11在高糖誘導(dǎo)的HRMECs中是通過活化Wnt/β-catenin通路發(fā)揮作用的。
綜上,本研究發(fā)現(xiàn),KIF11在高糖誘導(dǎo)的HRMECs中表達增加,降低KIF11表達可通過阻止Wnt/β-catenin通路活化,抑制高糖誘導(dǎo)的細胞增殖、遷移和血管生成。本研究進一步闡明了DR的發(fā)病機制,并為DR的治療提供新的理論基礎(chǔ)。抑制KIF11可能是未來治療DR的新策略。