王 輝鄭麗嬌于舒怡劉 麗關(guān)天舒李柏宏劉長遠

(1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,遼寧 沈陽 110161; 2.新民市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,遼寧 沈陽 110300)

疫病是辣椒設(shè)施生產(chǎn)的一種毀滅性土傳病害,嚴(yán)重制約了我國辣椒可持續(xù)生產(chǎn)與發(fā)展。 隨著種植面積的加大與復(fù)種指數(shù)的提高,辣椒疫病危害逐年加重[1]。 目前生產(chǎn)上該病的防治仍以化學(xué)藥劑為主,但長期不合理使用增加了防治潛在風(fēng)險[2,3],同時造成了果品與環(huán)境污染。 因此,生物防治作為綠色低風(fēng)險方法成為其替代技術(shù),備受關(guān)注。 已報道的用于辣椒疫病防治的拮抗菌主要為芽孢桿菌(Bacillusspp.)、 假單胞菌(Pseudomonasspp.)、木霉菌(Trichodermaspp.)和鏈霉菌(Streptomycesspp.)[4～9]。 越來越多的生防資源被發(fā)現(xiàn)的同時,其生防機理的研究也隨之深入,如細(xì)菌多為誘導(dǎo)植物抗性與促生長作用,真菌多為重寄生、競爭與抗生作用,放線菌則多通過次生代謝產(chǎn)物抑制疫霉菌生長[10],這對辣椒疫病的生物防治起到了積極推動作用。 近年研究發(fā)現(xiàn),曲霉屬(Aspergillus)次生代謝產(chǎn)物中含有多種對致病疫霉具有抑制作用的物質(zhì)[11,12],我國李淑彬等(2001)首先發(fā)現(xiàn)黃柄曲霉(Aspergillusflavoricum)可產(chǎn)生抗菌素179M 對疫霉菌多種病原真菌具有強烈抑制作用[13],葉旻碩等(2019)發(fā)現(xiàn)棘孢曲霉BAS1(Aspergillusaculeatus)可以提高移栽辣椒土壤芽孢桿菌數(shù)量、改變土壤的性狀,并在28 d時防效顯現(xiàn)[14];王光飛等(2019)研究發(fā)現(xiàn)曲霉屬真菌AS1 與AS2(Aspergillus)可顯著減少土壤中辣椒疫霉菌數(shù)量,其新鮮菌絲亦可協(xié)同生物質(zhì)炭作用提高抑菌作用[15]。

黃柄曲霉(A. flavoricum)作為曲霉屬真菌重要種類,其發(fā)酵液對多種動植物病原菌具有抑制或毒殺作用已經(jīng)被證實[16～18]。 本研究對象黃柄曲霉ASD 來源于遼寧省辣椒連作土壤,其發(fā)酵液對辣椒疫霉病有高效、穩(wěn)定防治效果已經(jīng)被證實[19],在此基礎(chǔ)上測定ASD 菌株胞外酶活性及其理化性質(zhì)穩(wěn)定性,以期為黃柄曲霉ASD 更廣闊的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 供試菌株

黃柄曲霉 ASD (Aspergillusflavipes)與辣椒疫霉BZ (Phytophthora.capsici)均由本研究室分離、鑒定并保存。 BZ 菌株為遼寧省優(yōu)勢3 號生理小種、A1 交配型,致病力中等。

1. 2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基[20]:用于擴繁培養(yǎng)。

JBZ 菌絲的制取:將純化的JBZ 菌株接種到PDA 培養(yǎng)液中25 ℃ 140 rpm 振蕩培養(yǎng) 7 d,無菌水5 000 rpm 15 min 清洗3 次,無菌濾紙吸干水份,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

誘導(dǎo)培養(yǎng)基:各成分質(zhì)量百分比如下:0. 1%蛋白胨,0.2% KH2PO4,1.4% (NH4)2SO4,0.03%MgSO4·7H20,0.1% 微量元素(Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+),碳源分別采用質(zhì)量百分比為5%、10%、15%的JBZ 菌絲。

1. 3 粗酶液的準(zhǔn)備

ASD 孢子懸浮液以1%的接種量接入辣椒菌絲含量分別為5%、10%、15%誘導(dǎo)培養(yǎng)液中,震蕩培養(yǎng)6d 后1. 5×104rpm 離心20min,去除JBZ 與ASD 菌絲及孢子,并用0. 22 μm 細(xì)菌過濾器除菌,即為待測粗酶液。 酶活性測定前進行稀釋,使光吸收值在0.25 ～0.4 范圍內(nèi)。

1. 4 胞外酶活性的測定

纖維素酶活性、木聚糖酶活性與1,3 葡聚糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸法[21～23],蛋白酶活性采用福林試劑法[24]。

1. 5 穩(wěn)定性測定

1. 5. 1 酸堿穩(wěn)定性

將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液pH 調(diào)至2 ～11,按1 ∶10與冷卻至40 ～50 ℃ PDA 培養(yǎng)基混勻制成平板。將JBZ 菌碟(d=7 mm)置于平板中央,25 ℃培養(yǎng)5 d 后,測量菌落直徑。 設(shè)pH 7.0 為對照,按下式計算抑菌率,3 次重復(fù)。

1. 5. 2 溶解性

利用不同極性有機溶劑:石油醚、甲苯、乙醚、乙酸乙酯、乙醇10 ml 與等體積的粗酶液進行混合萃取,靜置過夜后將上層有機相及下層水相按1 ∶10 與冷卻至40 ～50 ℃ PDA 培養(yǎng)基混勻制成平板,25 ℃培養(yǎng)5 d 后,測量菌落直徑。 按下式計算抑菌率,3 次重復(fù)。

1. 6 SD 毒性試驗

將純化的ASD 菌株接種到PDA 培養(yǎng)液中25 ℃ 140 rpm 振蕩培養(yǎng) 7 d,8 層無菌紗布過濾后進行動物經(jīng)皮經(jīng)口6 項急性毒性試驗,于沈陽化工研究院有限公司安全評價中心進行。

1. 7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2003 作圖,并利用SPSS 22. 4 進行鄧肯氏新復(fù)極差法(DMRT)進行0. 05 水平差異分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 ASD 菌株胞外酶活性

2. 1. 1 纖維素酶活性

脅迫后纖維素酶活性顯著提高(F=0. 05),酶活性隨著底物含量的增加而提高,底物含量為15%時酶活性最高。 3 個底物含量的酶活性隨時間變化趨勢一致:1 ～4 d 酶活性不斷增加,第4 d時纖維素酶達到最高,分別為;42.84 U/ml、54.87 U/ml、82.32 U/ml,4 ～5 d 酶活性陡然下降,5 d 后酶活性下降緩慢(圖1)。

圖1 纖維素酶活性變化Figure 1 Effect of ASD strain on CMC activity

2. 1. 2 木聚糖酶活性

脅迫后不同底物含量的木聚糖酶活性顯著提高(F=0. 05),隨著底物含量的增加木聚糖酶活性升高,在底物含量為15%時,酶活性最高。 其中;1 ～3 d 酶活性逐漸增加,第3 d 分別達到最高分別為64.88 U/ml、77.88 U/ml、83.47 U/ml,第3 d 后木聚糖酶活性開始下降,直至第10 d 酶活性最低(圖2)。

圖2 木聚糖酶活性變化Figure 2 Effect of ASD strain on xylanase activity

2. 1. 3 蛋白酶活性

脅迫后ASD 粗酶液中的蛋白酶活性變化復(fù)雜,底物含量為5%時酶活性最高,其次為15%,含量為10%蛋白酶活性最低。 處理后酶活性只顯著高于相同底物含量下的對照處理。 培養(yǎng)時間對ASD 發(fā)酵液中蛋白酶活性沒有明顯影響,抑菌率始終在10%～20%之間波動,說明ASD 的抑菌機理與蛋白酶活性關(guān)系不大(圖3)。

圖3 蛋白酶活性變化Figure 3 Effect of ASD strain on proteinase activity

2. 1. 4 β-1,3 葡聚糖酶活性

脅迫前ASD 粗酶液中β-1,3 葡聚糖酶活性很低,誘導(dǎo)后β-1,3 葡聚糖酶活顯著提高(F=0.05),且酶活性受底物含量與培養(yǎng)時間影響不大(圖4)。

圖4 β-1,3 葡聚糖酶活性變化Figure 4 Effect of ASD strain onβ-11,3-1Glucanase activity

2. 2 ASD 粗酶液理化性質(zhì)

2. 2. 1 耐酸堿性

酸堿耐性結(jié)果表明(表1),在誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h,pH 6 時抑菌率最高,可達77. 18%,其余依次為pH 7＞pH 8＞pH 5＞ pH 9＞pH 4＞pH 10,pH 10 抑菌率最低,為70.74%;誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h 時,pH 6 時抑菌率最高,其余依次為pH 5 ＞pH 7＞pH 4＞pH 8＞pH 9＞ pH 10;24 h 誘導(dǎo)后 pH 5 時抑菌率較高為72.42%,其次為pH 6＞pH 4＞pH 7＞ pH 8＞ pH 9＞pH 10;48h 抑菌率依次為pH 6 ＞pH 7＞pH 8＞pH 9＞pH 5＞ pH 4 ＞ pH 10。 結(jié)合差異顯著分析(F=0.05),ASD 粗酶液抑菌率在中性(pH 7)、微酸(pH 5 與pH 6)條件下較好。

表1 酸堿性對ASD 粗酶液抑菌率的影響Table 1 Effect of acid and alkalinity on the bacteriostatic rate of crude enzyme solution of ASD

相同pH 條件下,不同時間點抑菌率比較可以看出,pH 5、pH 6、pH 7 在不同時間點抑菌率表現(xiàn)趨勢一致:誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h 抑菌率最高,其次為12 h＞24 h＞48 h;pH 4、pH 8、pH 9 條件下抑菌率表現(xiàn)趨勢一致:6 h＞24 h＞12 h＞48 h,而pH 10 時抑菌則為6 h＞12 h＞48 h＞24 h。 總體可以看出,ASD 粗酶液抑菌率隨酸堿處理時間延長而降低,酸堿性處理與處理時間對抑菌率有一定影響,處理持效時間為36 h。

2. 2. 2 溶解性

用5 種極性不同的有機溶劑對發(fā)酵液進行萃取,試驗結(jié)果見表2,石油醚、甲苯、乙醚、乙酸乙酯均沒有將抑菌物質(zhì)萃取出,而水相中抑菌率55.55%～76.83%,說明抑菌物質(zhì)為親水性物質(zhì);但乙醇溶液萃取后無抑菌效果,可能是由于乙醇破壞了抑菌物質(zhì)。

表2 ASD 粗酶液抑菌物質(zhì)溶解性測定Table 2 Determination of solubility of antimicrobial substances in crude enzyme solution of ASD

2. 3 ASD 發(fā)酵液安全性評價

大鼠急性經(jīng)口毒性檢測、大鼠急性經(jīng)皮毒性與豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)(致敏)試驗與急性吸入毒性試驗均未出現(xiàn)中毒癥狀及死亡;兔急性皮膚刺激性試驗與兔急性眼刺激性試驗均未見刺激癥狀,說明ASD 對動物安全。

3 結(jié)論與討論

本研究以致病辣椒疫霉菌作為脅迫底物開展,黃柄曲霉ASD 菌株經(jīng)底物脅迫后次生代謝產(chǎn)物中纖維素酶與木聚糖酶酶活性變化顯著,且含量較高,而蛋白酶與β-1,3 葡聚糖酶活性變化則不顯著。 分析認(rèn)為,ASD 菌株分泌的纖維素酶與木聚糖酶酶,是防治辣椒疫霉菌的主要生防機制。許多研究表明,辣椒疫病生防菌可以通過競爭、拮抗、重寄生、促生抗病與誘導(dǎo)抗性等機理達到控制病害的目的[25,26]。 因此,辣椒疫病的生防機理往往不是單一的,而是多種機理并存的,孫敬祖等發(fā)現(xiàn)舒展曲霉F1(AspergilluseffusesTiraboschi)既可以分泌抑菌物質(zhì)抑制辣椒疫霉菌菌絲生長及游動孢子的萌發(fā),又提高辣椒植株體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活力,同時F1 較強的根部定殖能力又與疫霉菌產(chǎn)生空間競爭,從而達到對辣椒疫病較高的防治作用[14]。 謝梓語等(2018)研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B1409(Bacillus subtilis)可導(dǎo)致辣椒疫霉菌菌絲發(fā)生畸變,從而抑制辣椒疫霉菌菌絲的生長,同時可以提高辣椒植株體內(nèi)3 種防御酶活性[27]。 本研究對象黃柄曲霉ASD 已經(jīng)被證實可以改變辣椒罹病土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu),并提高土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶及脫氫酶活性[28],為開發(fā)ASD 菌株更多潛在的生防機制。 Pang ZL 等(2020) 與李騰蛟等(2019)研究表明,纖維素在疫霉菌生長發(fā)育和致病過程中起關(guān)鍵作用,是其難以防治的屏障,與本研究結(jié)果相符合[29,30]。

目前有許多研究表明,生防菌可以在有底物脅迫情況下,特別是致病菌脅迫下可產(chǎn)生或提高胞外酶活性,張紅霞研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌HT-6(Bacillussubtilis)在與致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)共培養(yǎng)后可誘導(dǎo)師HT-6 產(chǎn)生纖維素酶,在對峙培養(yǎng)中HT-6 產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可導(dǎo)致疫霉菌菌絲畸形,從而抑制生長[31]。 此外,許多學(xué)者利用真菌細(xì)胞壁的主要成分纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖與葡聚糖等做為底物對生防真菌、細(xì)菌與放線菌的次生代謝產(chǎn)物進行脅迫,均獲得較高的抑菌活性酶[32～35]。 本研究結(jié)果表明,ASD 菌株在致病疫霉菌為底物的條件協(xié)迫下可以獲得較高活性的細(xì)胞壁降解酶:纖維素酶與木聚糖酶,這與前人研究結(jié)果一致,是ASD 主要的生防抑菌機制。而在未發(fā)病及健康土壤中ASD 菌株是不會分泌過多的胞外酶破壞或改變原有的土壤環(huán)境,這是化學(xué)農(nóng)藥所不具備的生物自動調(diào)節(jié)功能。 此外,ASD 粗酶液在中性與微酸環(huán)境中仍能保持較高的抑菌活性。 綜上,黃柄曲霉ASD 具有廣闊的應(yīng)用前景。