劉亭亭, 汪漢成, 孫美麗, 尹國(guó)英, 張 盼,向立剛, 蔡劉體, 孟建玉, 張長(zhǎng)青

(1. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng) 550081；2. 長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

煙草Nicotiana tabacumL. 是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙草赤星病 tobacco brown spot 是其成熟期的主要真菌性病害，其病原菌為子囊菌門鏈格孢屬Alternariaspp.。該病原菌寄主范圍廣，煙草、棉花和柑橘等均可被其侵染[1-3]。赤星病的危害常給煙農(nóng)造成重大損失。生產(chǎn)上常用波爾多液進(jìn)行預(yù)防，該藥劑是一種廣譜性、不易產(chǎn)生抗藥性、成本低的保護(hù)性殺菌劑[4]，被廣泛用于煙草、果樹等作物病害的防控[5]。波爾多液有效成分為堿式硫酸銅，在酸性條件下轉(zhuǎn)化為可溶的硫酸銅，產(chǎn)生少量銅離子 (Cu2+)，Cu2+通過破壞病菌細(xì)胞的蛋白酶，從而使菌體代謝作用受阻，起到殺滅病菌的作用，對(duì)真菌和細(xì)菌均有抑菌活性[6]。

葉際微生物，1981 年由Blackman 首次提出，即附生或寄生于植物葉面的微生物[7]，其中還含有許多有益微生物，它們通過與寄主植物的相互作用，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[8]；可以提高植物對(duì)病原菌的抗病性[9]等。當(dāng)葉際微生物菌群失調(diào)后，往往會(huì)引起嚴(yán)重的后果，如冰核活性細(xì)菌可以誘發(fā)植物產(chǎn)生凍害[10]，病原菌數(shù)量增加，引起植物病害[11]等。煙草葉際存在包括病原菌在內(nèi)的大量微生物，它們影響著煙葉的健康與產(chǎn)量。葉際微生物的群落結(jié)構(gòu)與代謝功能是評(píng)價(jià)葉際微生態(tài)的2 個(gè)重要指標(biāo)。波爾多液作為經(jīng)典藥劑，在煙草上已使用多年，而大眾對(duì)煙葉葉際微生物的調(diào)控規(guī)律尚缺乏了解。為此，本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法測(cè)定了波爾多液對(duì)煙草赤星病菌的毒力，并采用高通量測(cè)序與Biolog 代謝表型技術(shù)分別測(cè)定了波爾多液對(duì)煙葉健康與感病組織葉際微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝功能的影響，旨在了解藥劑的微生態(tài)調(diào)控規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試藥劑 80%波爾多液可濕性粉劑 (WP)(有效成分：硫酸銅 + 氫氧化鈣)，購(gòu)自沈陽(yáng)紅旗林藥公司。

1.1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)及品種 供試煙草品種為‘云煙105’。于2020 年8 月底，在貴州省畢節(jié)市威寧彝族回族苗族自治縣黑石頭鎮(zhèn)，選擇赤星病病葉率約為10%的煙地進(jìn)行田間試驗(yàn)。

1.1.3 供試菌株與培養(yǎng) 供試菌株為煙草赤星病菌菌株CXB (保藏于貴州省煙草研究院真菌實(shí)驗(yàn)室)。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)：將200 g去皮的馬鈴薯放于1 000 mL 沸水中蒸煮30 min，用8 層紗布過濾得到澄清濾液，向?yàn)V液中加入20 g葡萄糖和15 g 瓊脂混勻，并用蒸餾水定容至1 000 mL，滅菌、備用。

1.1.4 其他供試材料 Biolog ECO 代謝板 (貨號(hào)：1056)，購(gòu)自美國(guó)Biolog 公司 (USA，CA，Hayward)；GeneJET 膠回收試劑盒 (貨號(hào)：K0691) 和Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒 (貨號(hào)：4471252)，均購(gòu)自Thermo Scientific 公司。DSF01A-20-100 多功能噴霧施肥器，購(gòu)自貴州黔豐源農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司。

1.2 波爾多液對(duì)煙草赤星病菌的毒力

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[12]測(cè)定波爾多液對(duì)煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的毒力。用6 mm 打孔器打取煙草赤星病菌CXB 邊緣菌絲塊，挑取菌絲塊分別置于波爾多液終質(zhì)量濃度為1 600、800、400、200和100 mg/L 的PDA 平板上，以不加藥的PDA 平板作對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)4 個(gè)重復(fù)。于30 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)照組菌落將長(zhǎng)滿平皿時(shí)定，采用“十字交叉”法量取每個(gè)平板的菌落直徑。

采用孢子萌發(fā)法[13]測(cè)定波爾多液對(duì)煙草赤星病菌孢子萌發(fā)的毒力。用無(wú)菌去離子水將在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d 的煙草赤星病菌CXB 產(chǎn)生的分生孢子洗下，雙層紗布過濾得到孢子懸浮液，在顯微鏡下調(diào)節(jié)孢子濃度為105～106個(gè)/mL。將藥劑與PDA 培養(yǎng)基混勻，采用倍半稀釋法，配制質(zhì)量濃度梯度為1 600、800、400、200 和100 mg/L 的含藥PDA 平板，移取100 μL 孢子懸浮液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，置于30 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。以不加藥劑為空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)8 h 后顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，以芽管長(zhǎng)度大于孢子短半徑視為萌發(fā)，待對(duì)照萌發(fā)率達(dá)到90%以上時(shí)記錄各處理孢子萌發(fā)情況。

1.3 波爾多液對(duì)煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與代謝功能的影響

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)波爾多液和清水對(duì)照2 個(gè)處理，各小區(qū)隨機(jī)排列，每小區(qū)60 株煙株。80%波爾多液WP 的用量為1 500 g/hm2，用水量為900 L/hm2。用背負(fù)式噴霧器正、反葉面均勻噴施，以藥液能夠均勻噴霧至小區(qū)所有植株葉片為準(zhǔn)；對(duì)照組噴施清水。小區(qū)之間設(shè)保護(hù)行，避免重噴、漏噴或影響到相鄰小區(qū)。

1.3.2 樣品采集 分別于施藥前0 d 及施藥后5、10 和15 d 取樣，采集波爾多液處理前后的煙葉樣品用于后續(xù)試驗(yàn)。用消過毒的剪刀剪取下部感病部位與健康部位煙葉樣品，分別裝入50 mL 無(wú)菌離心管中，每個(gè)處理3 次重復(fù)。樣品采集后放入低溫保存箱，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室開展Biolog ECO代謝功能研究，剩余樣品置于 -80 ℃冰箱保存、備用，樣品編號(hào)如表1 所示。

表1 樣品采集信息Table 1 Samples information

1.3.3 波爾多液對(duì)煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響 采用CTAB (Cetyltrimethylammonium Bromide) 法[14]進(jìn)行煙葉葉際微生物基因組DNA的提取，樣品DNA 的純度和濃度用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將提取的DNA 置于離心管中，用無(wú)菌水稀釋至濃度為1 ng/μL，以此為模板，使用引物ITS1-5F-F (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′) 和ITS1-1F-R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′)、及515F (5′-GTGCCAGCMGCCGC GGTAA-3′) 和806R (5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′) 分別對(duì)真菌ITS1 區(qū)域與細(xì)菌V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。參照劉暢等[15]和Chen 等[16]的方法進(jìn)行多樣性測(cè)序與分析，真菌和細(xì)菌分別通過UNITE(7.2) 和SILVA132 的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，此過程在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3.4 波爾多液對(duì)煙葉葉際微生物代謝功能的影響 分別取不同時(shí)期不同部位煙葉混合樣品各1 g，置于盛有50 mL 0.8%的無(wú)菌生理鹽水的100 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min 振蕩搖培2 h，靜置30 min 后取100 μL 上清液，分別加入到ECO代謝板的測(cè)試孔中[17]。將接菌后的ECO 代謝板置于OmniLog 恒溫培養(yǎng)箱中，于28 ℃條件下培養(yǎng)7 d，采用Biolog D5E_OKA_data.exe 軟件收集煙葉葉際微生物在生長(zhǎng)過程中代謝孔內(nèi)顏色變化值，使用HemI 軟件制作熱圖[18]，分析葉際微生物的代謝功能。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2019、DPS7.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 波爾多液對(duì)煙草赤星病菌的毒力

如表2 所示，波爾多液對(duì)煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)均有抑制作用，且隨著藥劑濃度的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，其中對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性較強(qiáng)。波爾多液抑制菌絲生長(zhǎng)的EC50值和EC95值分別為450.19 和4 987.45 mg/L；抑制孢子萌發(fā)的EC50值和EC95值分別為757.17 和3 108.01 mg/L。在藥劑質(zhì)量濃度為1 600 mg/L時(shí)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的抑制率分別為79.56%和82.41%。

表2 波爾多液對(duì)煙草赤星病菌的毒力Table 2 Toxicity test of Bordeaux mixture to Alternaria alternata

2.2 波爾多液對(duì)煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響

2.2.1 波爾多液對(duì)煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響2.2.1.1 對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響 在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門水平上，施藥前健康 (BEJ0) 與感病 (BEB0) 煙葉葉際優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門 (Proteobacteria，6.93%和39.07%) 和厚壁菌門 (Firmicutes，16.45%和0.65%)。波爾多液處理5 d 時(shí)，健康 (BEJ1) 和感病 (BEB1) 煙葉葉際變形菌門的相對(duì)豐度均有所下降，健康 (BEJ1) 煙葉葉際厚壁菌門的相對(duì)豐度下降較多；處理10 d 時(shí)，感病 (BEB2) 煙葉葉際厚壁菌門相對(duì)豐度顯著增加，而健康 (BEJ2) 煙葉葉際變形菌門相對(duì)豐度有所增加；處理15 d 時(shí)，健康 (BEJ3) 和感病 (BEB3) 煙葉葉際變形菌門相對(duì)豐度均有增加 (圖1)。

圖1 波爾多液對(duì)煙葉葉際細(xì)菌門 (A) 和屬(B)水平上的群落組成的影響Fig.1 The effects of Bordeaux mixture on the community composition of bacteria in the phyllosphere of tobacco at phyla(A) and genera(B) levels

在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)屬水平上，施藥前健康 (BEJ0)與感病 (BEB0) 煙葉葉際優(yōu)勢(shì)菌屬為Kosakonia(3.46%和22.38%) 和假單胞菌屬 (Pseudomonas，0.22%和5.95%)，與感病 (BEB0) 煙葉相比，健康(BEJ0) 煙葉的魏斯氏菌屬 (Weissella，15.26%) 顯著高于感病 (BEB0) 煙葉 (0.00%)。波爾多液處理5 d 時(shí)，健康 (BEJ1) 和感病 (BEB1) 煙葉葉際Kosakonia、鞘脂單胞菌屬 (Sphingomonas) 和乳桿菌屬 (Lactobacillus) 相對(duì)豐度降低，而假單胞菌屬(Pseudomonas)、勞爾氏菌屬 (Ralstonia)、馬賽菌屬 (Massilia)、未分類的腸桿菌科 (unidentified_Enterobacteriaceae)、未分類的立克次體目 (unidentified_Rickettsiales)、沙雷氏菌屬 (Serratia) 相對(duì)豐度明顯上升。處理10 d 時(shí)，健康 (BEJ2) 和感病 (BEB2)煙葉葉際Kosakonia和鞘脂單胞菌屬相對(duì)豐度持續(xù)降低或不變，假單胞菌屬和馬賽菌屬 (Massilia) 相對(duì)豐度開始降低，而勞爾氏菌屬和沙雷氏菌屬相對(duì)豐度持續(xù)增加。處理15 d 時(shí)，健康 (BEJ3) 和感病 (BEB3) 煙葉葉際Kosakonia相對(duì)豐度開始上升，沙雷氏菌屬相對(duì)豐度持續(xù)增加 (圖1)。

2.2.1.2 對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響 在真菌群落結(jié)構(gòu)門水平上，施藥前健康 (BEJ0) 與感病 (BEB0) 煙葉葉際優(yōu)勢(shì)菌門均為子囊菌門 (Ascomycota，63.82%和93.74%) 和擔(dān)子菌門 (Basidiomycota，6.82%和2.53%)。波爾多液處理5 d 時(shí)，感病 (BEB1)煙葉葉際子囊菌門相對(duì)豐度小幅度增長(zhǎng)，擔(dān)子菌門相對(duì)豐度小幅度下降，而健康 (BEJ1) 煙葉中子囊菌門相對(duì)豐度大幅度減少，擔(dān)子菌門相對(duì)豐度大幅度增長(zhǎng)。處理10 d 時(shí)，感病 (BEB2) 煙葉中子囊菌門相對(duì)豐度出現(xiàn)較大幅度降低，擔(dān)子菌門相對(duì)豐度出現(xiàn)較大幅度增長(zhǎng)，而健康 (BEJ2) 煙葉中則與之相反。處理15 d 時(shí)，感病 (BEB3) 煙葉中子囊菌門和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度同時(shí)降低，而健康 (BEJ3) 煙葉中子囊菌門相對(duì)豐度降低，擔(dān)子菌門相對(duì)豐度增長(zhǎng) (圖2)。

圖2 波爾多液處理對(duì)煙葉葉際真菌門 (A) 和屬(B)水平上的群落組成的影響Fig.2 The effects of Bordeaux mixture on the community composition of fungi in the phyllosphere of tobacco at phyla(A) and genera(B) levels

在真菌群落結(jié)構(gòu)屬水平上，施藥前健康 (BEJ0)與感病 (BEB0) 煙葉葉際真菌屬水平主要菌群為鏈格孢屬 (Alternaria，36.48% 和84.52%)、Symmetrospora(5.56% 和2.27%) 和枝孢霉屬(Cladosporium，14.87%和6.66%)，與健康 (BEJ0)煙葉相比，感病 (BEB0) 樣品的鏈格孢屬 (84.52%)顯著高于健康樣品 (36.48%) (P＜0.05)。波爾多液處理5 d 時(shí)，健康 (BEJ1) 與感病 (BEB1) 煙葉葉際鏈格孢屬、Symmetrospora、枝孢霉屬、Hannaella、亡革菌屬 (Thanatephorus)、Vishniacozyma6 個(gè)菌屬相對(duì)豐度下降，而亞隔孢殼屬 (Didymella)、綠僵菌屬 (Metarhizium)、木耳屬 (Auricularia)、鐮孢菌屬 (Fusarium)、附球菌屬 (Epicoccum)、尾孢屬(Cercospora)、被孢霉屬 (Mortierella)、沙蜥屬(Saitozyma)、Plectosphaerella、Papiliotrema10 個(gè)菌屬菌群相對(duì)豐度均上升。處理10 d 時(shí)，健康(BEJ2) 與感病 (BEB2) 煙葉葉際鏈格孢屬、亡革菌屬相對(duì)豐度持續(xù)降低，綠僵菌屬、鐮孢屬、被孢霉屬、Plectosphaerella和Papiliotrema相對(duì)豐度持續(xù)上升，Vishniacozyma相對(duì)豐度開始上升。處理15 d 時(shí)，健康 (BEJ3) 與感病 (BEB3) 煙葉葉際鏈格孢屬相對(duì)豐度持續(xù)降低，Papiliotrema相對(duì)豐度開始降低，其余則呈不規(guī)律增減 (圖2)。

花瓣圖分析結(jié)果表明 (圖3)，在可操作分類單元 (OTU) 水平下，各樣本細(xì)菌、真菌群落分別共有OTU 種類數(shù)為6 和39 種，共有的細(xì)菌屬為Kosakonia、假單胞菌屬及未分類的立克次體目等，共有的真菌屬為鏈格孢屬、亞隔孢殼屬、Symmetrospora及枝孢霉屬等，施藥前健康與感病煙葉細(xì)菌群落獨(dú)有的OTU 種類數(shù)分別為12 和6 種，真菌群落獨(dú)有的OTU 種類數(shù)分別為3 和50 種。波爾多液處理5 和10 d 時(shí)，健康與感病煙葉細(xì)菌、真菌群落獨(dú)有的OTU 種類數(shù)均有所上升。處理15 d 時(shí)，其獨(dú)有的OTU 種類數(shù)開始降低，而感病煙葉的真菌群落種類數(shù)持續(xù)上升。

圖3 波爾多液處理煙葉葉際細(xì)菌 (A) 和真菌(B)群落OTU 分布花瓣圖Fig.3 Flower map of OTU distribution of bacterial(A) and fungal(B) communities in phyllosphere of tobacco treated with Bordeaux mixture

2.2.2 波爾多液對(duì)煙葉葉際微生物群落多樣性的影響 由表3 可知：健康與感赤星病煙葉葉際真菌和細(xì)菌測(cè)序覆蓋度指數(shù)均達(dá)到0.90 以上，表明所有樣品測(cè)序數(shù)據(jù)合理，可以真實(shí)、合理地反映微生物群落的多樣性。

細(xì)菌多樣性結(jié)果 (表3) 表明：處理前，健康煙葉 (BEJ0) 葉際細(xì)菌多樣性指數(shù) (Shannon) 和豐富度指數(shù) (Chao1、ACE) 均高于感病煙葉 (BEB0)，但無(wú)顯著性差異。處理5 d 時(shí)，感病煙葉 (BEB1) 葉際細(xì)菌多樣性指數(shù)顯著高于健康煙葉 (BEJ1)。處理10 d 時(shí)，感病煙葉 (BEB2) 與健康煙葉 (BEJ2)葉際細(xì)菌豐富度指數(shù)達(dá)到最高值。處理15 d 時(shí)，感病煙葉樣品 (BEB3) 與健康煙葉 (BEJ3) 葉際細(xì)菌豐富度指數(shù)降低，但無(wú)顯著性差異。

表3 波爾多液對(duì)煙葉葉際微生物多樣性的影響 (OTU 水平)Table 3 Effect of Bordeaux mixture on the diversity of tobacco phyllosphere microorganism (OTU level)

真菌多樣性結(jié)果 (表3) 表明，施藥前，健康煙葉 (BEJ0) 葉際真菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均高于感病煙葉 (BEB0)，但豐富度之間無(wú)顯著性差異。波爾多液處理5 和10 d 時(shí)，感病煙葉 (BEB1、BEB2) 葉際真菌與健康煙葉 (BEJ1、BEJ2) 多樣性與豐富度指數(shù)增長(zhǎng)。處理15 d 時(shí)，感病煙葉 (BEB3)葉際真菌豐富度指數(shù)顯著高于健康煙葉 (BEJ3)。

2.3 波爾多液對(duì)煙葉葉際微生物代謝功能的影響

Biolog ECO 微孔板中含有糖類、氨基酸、羧酸類、雙親化合物、聚合物和胺/氨基化合物共31 種碳源。波爾多液對(duì)煙葉葉際微生物代謝功能的影響結(jié)果如圖4 所示，施藥前，感病 (BEB0) 與健康 (BEJ0) 煙葉微生物均可高效代謝 (顏色值變化值＞200) 除氨基酸類的L-蘇氨酸 (L-threonine) 和羧酸類的α-丁酮酸 (α-ketobutyric acid) 外的29 種碳源，感病 (BEB0) 煙葉無(wú)特有高效代謝的碳源。

圖4 波爾多液處理煙葉葉際微生物代謝功能的聚類熱圖Fig.4 Cluster heat map of the effect of Bordeaux mixture on the metabolism of tobacco phyllosphere microorganism

噴施波爾多液5、10 和15 d 后，健康與感病煙葉葉際微生物代謝功能均被不同程度抑制。健康煙葉葉際微生物的代謝功能表明，波爾多液處理5 d 時(shí)，葉際微生物對(duì)31 種碳源的代謝均被抑制，無(wú)高效代謝碳源；處理10 d 時(shí)，葉際微生物的代謝功能逐漸恢復(fù)，但仍有23 種碳源的代謝被抑制，包括β-甲基-D-葡萄糖苷、L-精氨酸、丙酮酸甲酯等，代謝高的碳源有8 種碳源，包括D-半乳糖酸內(nèi)酯、D-葡萄糖胺酸、L-天冬酰胺等；處理15 d 時(shí)，葉際微生物的代謝功能進(jìn)一步加強(qiáng)，6 種碳源的代謝仍被抑制，包括2-羥基苯甲酸、L-精氨酸、D-木糖等，24 種碳源能被高效代謝，包括β-甲基-D-葡萄糖苷、丙酮酸甲酯和吐溫40 等。

相比而言，感病煙葉葉際微生物的代謝功能表明，波爾多液處理5 d 時(shí)，葉際微生物對(duì)17 種碳源的代謝被抑制，包括D-半乳糖酸內(nèi)酯、丙酮酸甲酯、D-木糖等，但可高效代謝13 種碳源，包括β-甲基-D-葡萄糖苷、L-精氨酸、D-葡萄糖胺酸等；處理10 d 時(shí)，葉際微生物對(duì)7 種碳源的代謝被抑制，包括D-木糖、I-赤蘚糖醇、2-羥基苯甲酸等，可高效代謝22 種碳源，包括β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖酸內(nèi)酯、丙酮酸甲酯等；處理15 d 時(shí)，葉際微生物對(duì)3 種碳源的代謝被抑制，為D-木糖、2-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲酸，但可高效代謝28 種碳源，包括β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖酸內(nèi)酯、L-精氨酸等。

3 結(jié)論與討論

本研究中，波爾多液對(duì)煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的EC50值均大于450 mg/L，活性較低。這可能與波爾多液的作用機(jī)理有關(guān)，它主要通過釋放的銅離子來殺菌，銅離子的作用靶標(biāo)雖然較多，但活性較弱。為此，該藥劑適合做保護(hù)性藥劑，噴施后在葉片形成一層保護(hù)膜，起到抑制病菌萌發(fā)的作用。

碳源是微生物生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，Biolog ECO代謝板含有大部分微生物生存所需的31 種常見碳源，可以反映煙葉葉際微生物的營(yíng)養(yǎng)需求特性。本研究測(cè)定了感赤星病煙葉葉際微生物對(duì)糖類、氨基酸、羧酸類、雙親化合物和聚合物以及胺/氨基化合物碳源的代謝利用情況，發(fā)現(xiàn)羧酸類的代謝利用程度低于其他5 類碳源。該結(jié)果與張文艷[19]及周運(yùn)來等[20]的研究結(jié)果類似。推測(cè)煙草葉際微生物不喜偏酸性的碳源，今后可以嘗試采用羧酸類碳源的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控來防控?zé)煵莩嘈遣?，相關(guān)假設(shè)有待下一步驗(yàn)證。噴施波爾多液后，健康與感病煙葉葉際微生物的代謝功能與施藥前相比有所變化，可抑制對(duì)β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖酸內(nèi)酯等絕大多數(shù)碳源代謝，抑制作用可達(dá)5 d，之后微生物對(duì)碳源的代謝程度均有不同程度的上升，且對(duì)健康葉際微生物的影響大于感病組織，表明波爾多液適合用作保護(hù)性藥劑，且持效期相對(duì)較短。

葉際微生物的多樣性與宿主植物的健康生長(zhǎng)息息相關(guān)，施藥前健康煙葉的真菌、細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均高于感病煙葉，與Chen 等[21]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥發(fā)病葉片內(nèi)微生物多樣性降低的結(jié)果一致，表明植株可通過調(diào)節(jié)葉際微生物菌群平衡來保證自身健康。施藥5 d 后，感病和健康煙葉的真菌、細(xì)菌的多樣性指數(shù) (Shannon)和豐富度指數(shù) (Chao1、ACE) 大多數(shù)高于施藥前，與韓永琴[22]發(fā)現(xiàn)施用化學(xué)藥劑后根際土壤菌群豐富度及多樣性增加的結(jié)果一致，表明藥劑的使用對(duì)微生物種群存在影響，其原因可能是施用藥劑后刺激了某些菌群 (如：細(xì)菌的假單胞菌屬、勞爾氏菌屬和馬賽菌屬等；真菌的亞隔孢殼屬、綠僵菌屬和木耳屬等) 的大量繁殖。而某些植物致病菌的大量繁殖，則有可能會(huì)引起病原菌產(chǎn)生復(fù)合侵染，導(dǎo)致煙株發(fā)病更嚴(yán)重。

高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感病與健康煙葉優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Kosakonia和假單胞菌屬，這與劉暢等[15]的研究結(jié)果類似，本研究發(fā)現(xiàn)煙葉葉際同時(shí)也存在勞爾氏菌屬[23]、鞘脂單胞菌屬[24]等菌屬細(xì)菌。感病與健康煙葉優(yōu)勢(shì)真菌屬為鏈格孢屬、Symmetrospora和枝孢霉屬，與劉暢等[25]、向立剛等[26]發(fā)現(xiàn)感赤星病鮮煙葉和烤后煙葉優(yōu)勢(shì)真菌屬的研究結(jié)果類似。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)亞隔孢殼屬[27]、鐮孢屬[28]等致病真菌的存在。施用藥劑后，植物葉際或根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施波爾多液后，煙草葉際真菌群落中鏈格孢屬和枝孢霉屬等相對(duì)豐度降低，該結(jié)果與前人研究結(jié)果[29-31]一致。在本研究中，波爾多液不僅作用于鏈格孢屬等植物致病菌，對(duì)鞘脂單胞菌屬、Kosakonia等有益菌群也產(chǎn)生了抑制作用[32]，Kosakonia是一種固氮菌，可以幫助植物有效進(jìn)行氮利用吸收[33]，而這類菌群的改變可能會(huì)直接影響植物的各種生理代謝活動(dòng)，進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)。目前，有關(guān)殺菌劑對(duì)煙葉葉際微生態(tài)影響的研究報(bào)道較少，本研究結(jié)果可為殺菌劑防控植物病害的微生態(tài)機(jī)制提供參考。由于煙草赤星病為葉部真菌性病害，噴施藥劑時(shí)，主要噴施在葉片上，散落在地面的不多，因此本次試驗(yàn)重點(diǎn)研究其對(duì)葉際微生物的影響，下一步將繼續(xù)開展波爾多液對(duì)煙草根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與代謝功能影響的研究。