李鑌罡 ，肖海俠 ，艾柯代·吐魯洪 ，楊學(xué)云 ，馬萬鵬 ，劉璐瑤 ，蘇戰(zhàn)強(qiáng) ，3*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2. 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830011；3. 新疆草食動(dòng)物新藥研究與創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052）

奶牛蹄病是各種蹄病的總稱，發(fā)生在奶牛的四肢，包括蹄皮炎、蹄葉炎、白線病和蹄底潰瘍等。牛蹄病是規(guī)?；?chǎng)最常見且危害較嚴(yán)重的疾病之一，除了導(dǎo)致奶牛跛行，蹄病還會(huì)對(duì)牛只的生產(chǎn)、繁殖及行為造成影響，同時(shí)還會(huì)降低動(dòng)物福利，繼而直接或間接的造成經(jīng)濟(jì)損失，有調(diào)查表明每一頭患蹄病的奶牛在整個(gè)泌乳期可造成0.114 ～0.320 萬元的損失[1'2]，有些牛場(chǎng)因蹄病造成的經(jīng)濟(jì)損失甚至超過其養(yǎng)殖成本的一半。奶牛蹄皮炎是指蹄后跟系部皮膚出現(xiàn)潰爛與炎癥并在病灶周圍形成白色邊緣伴有長(zhǎng)毛發(fā)狀或其周邊附著較厚的多毛性疣。 奶牛蹄皮炎是一種細(xì)菌性疾病，當(dāng)牛患蹄皮炎時(shí)，患處表現(xiàn)為有腐敗氣味，表皮增厚和腫脹，高發(fā)于牛蹄系部于指間（趾），蹄底皮膚過度角質(zhì)化，如果未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)該病，患處則會(huì)破潰脫落出血，導(dǎo)致創(chuàng)面暴露于環(huán)境中，繼發(fā)深層感染，且會(huì)有分泌物滲出，四肢的指（趾）間和系部均可發(fā)病，有時(shí)形成結(jié)痂[3]。發(fā)病奶牛大多體溫正常，跛行程度因嚴(yán)重性而表現(xiàn)不一。奶牛蹄皮炎發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，引起奶牛蹄皮炎的因素多種多樣，其中包括管理因素[4'5]、生理因素[6]、行為因素[7]、遺傳因素[8，9]等。

在前期的調(diào)查中新疆烏魯木齊周邊地區(qū)的奶牛蹄病以蹄皮炎為主，占蹄病的88.24%，傳統(tǒng)的微生物分離鑒定方法存在一些局限性， 有許多的細(xì)菌在樣本中含量相對(duì)較少或難以制造某些細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境，導(dǎo)致無法培養(yǎng)或生長(zhǎng)發(fā)育不良[10]。 如果不能將全部細(xì)菌分離鑒定，便不能全面的反應(yīng)樣本中的菌群分布情況，因此需借助高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)奶牛蹄部腐肉樣本中的菌群進(jìn)行多樣性的分析，為以后的研究提供數(shù)據(jù)參考。 本研究采集奶牛蹄皮炎樣本和健康奶牛蹄樣本，通過Ⅰllumina NovaSeq 二代測(cè)序技術(shù)研究其微生物的菌落結(jié)構(gòu)，分析奶牛蹄皮炎樣本中的菌落組成，為奶牛蹄皮炎的防控提供更全面的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

NanoDrop ND-1000 分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo 公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)賽多利斯公司；PCR 儀，美國(guó)Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理

從新疆昌吉地區(qū)某2 個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)（A，B）采集健康奶牛蹄樣本和奶牛蹄皮炎樣本各10 份，其中5份為 A 場(chǎng)奶牛蹄皮炎樣本（A_FR1、A_FR2、A_FR3、A_FR4、A_FR5）、5 份為 A 場(chǎng)健康牛蹄部樣本（A_JK1、A_JK2、A_JK3、A_JK4、A_JK5）、5 份為 B 場(chǎng)蹄部腐肉樣本（B_FR1、B_FR2、B_FR3、B_FR4、B_FR5）、5 份為B 場(chǎng)健康牛蹄部樣本（B_JK1、B_JK2、B_JK3、B_JK4、B_JK5）。采樣前使用生理鹽水將患蹄表面糞污沖洗干凈，使用消毒后的修蹄刀暴露患處，用消毒后的剪刀采集蹄皮炎腐肉并使用滅菌棉簽蘸取健康蹄部拭子，分別放于高壓處理后的5 mLEP 管低溫保存，將樣品標(biāo)記后迅速送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 16S rRNA 基因 V3-4 區(qū)的 PCR 擴(kuò)增

使用離心機(jī)將樣品1 200 rpm／min 離心3 min，對(duì)樣本使用基因組DNA 試劑盒提取基因組模板，提取步驟參照說明書。 使用分光光度計(jì)與1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA 模板進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)， 并調(diào)整DNA 濃度。 DNA 質(zhì)量達(dá)標(biāo)后使用引物 338F-806R （338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3''806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)細(xì)菌 16S rRNA 基因 V3-V4 區(qū)的 PCR 擴(kuò)增[11]。 反應(yīng)程序：98 °C，2 min ＋（98 °C，15 s ＋ 55 °C，30 s ＋ 72 °C，30 s）× 25 ＋ 72 °C，5 min。 將合格的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收，并使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 分析試劑盒對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)， 將PCR 產(chǎn)物委托上海派森諾生物技術(shù)有限公司的Illlumina NovaSeq6000 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

使用Qiime （1.9.1） 軟件對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、 過濾與去嵌合體， 得到有效序列。 調(diào)用UCLUST 將有效序列按97%的序列相似度歸類和可操作分類單元?jiǎng)澐?，并在結(jié)果中篩選豐度較高的可操作分類單元，選為代表序列。 使用Greengenes 數(shù)據(jù)庫（Release 13.8）將可操作分類單元進(jìn)行查詢比對(duì)，將其進(jìn)行物種注釋，并統(tǒng)計(jì)樣本在不同分類水平的豐度情況。 對(duì)可操作分類單元的序列數(shù)進(jìn)行稀疏曲線分析 。 使 用 Qiime 軟 件 計(jì) 算 各 樣 本 的 Chao1、Faith-pd、Good coverage、Shannon、Simpson、Pielou-e 和Observed species 多樣性指數(shù)，并根據(jù)Bray-Curtis 距離算法使用R 語言得到Beta 多樣性距離矩陣。 使用UPGMA 的加權(quán)平均法對(duì)樣本中屬水平豐度靠前的菌群進(jìn)行聚類分析，并對(duì)其繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alpha 多樣性分析

本研究通過計(jì)算 Chao1、Faith-pd、Good coverage、Shannon、Simpson、Pielou-e 和 Observed species 多樣性指數(shù)對(duì)A 和B 兩牛場(chǎng)中奶牛蹄皮炎樣本和健康奶牛蹄樣本進(jìn)行Alpha 多樣性分析， 結(jié)果如圖1 所示，A 牛場(chǎng)奶牛蹄皮炎樣本于健康蹄樣本和B 牛場(chǎng)奶牛蹄皮炎樣本于健康蹄樣本各個(gè)指數(shù)均值差異性均顯著（P < 0.05），且各個(gè)樣本的Coverage 值范圍為0.9430 ～0.9966，表明測(cè)序基本覆蓋到了全部的OUT 數(shù)據(jù)，可反映樣本的真實(shí)情況。

圖1 A_FR、B_FR、A_JK 和 B_JK 組樣本群落 Alpha 多樣性指數(shù)

2.2 Beta 多樣性分析

通過主坐標(biāo)分析（Principal coordinate analysis，PCoA)發(fā)現(xiàn)A 牛場(chǎng)蹄皮炎樣本和A 牛場(chǎng)健康奶牛蹄樣本之間及B 牛場(chǎng)蹄皮炎樣本和B 牛場(chǎng)健康奶牛蹄樣本之間聚集在一起的微生物群落結(jié)構(gòu)差異度較大，見圖2。 PERMANOVA 差異檢驗(yàn)分析表明A 牛場(chǎng)蹄皮炎樣本組和A 牛場(chǎng)健康奶牛蹄樣本組、B 牛場(chǎng)蹄皮炎樣本組和B 牛場(chǎng)健康奶牛蹄樣本組、A 牛場(chǎng)蹄皮炎樣本組和B 牛場(chǎng)蹄皮炎樣本組菌群結(jié)構(gòu)差異顯著（P<0.05）；A 牛場(chǎng)健康奶牛蹄樣本組和B 牛場(chǎng)健康奶牛蹄樣本組菌群結(jié)構(gòu)差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 A 牛場(chǎng)奶牛蹄皮炎樣本組、B 牛場(chǎng)奶牛蹄皮炎樣本組、A 牛場(chǎng)健康奶牛蹄樣本組和B 牛場(chǎng)健康奶牛蹄樣本組菌群的PCoA

2.3 在門分類水平上的細(xì)菌組成

利用QIIME 軟件分析犢牛肺炎樣本和健康樣本在門分類水平上豐度前10 個(gè)物種。 結(jié)果表明，在奶牛蹄皮炎腐肉樣本中，A 場(chǎng)的優(yōu)勢(shì)菌分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和梭桿菌門（Fusobacteria） 等；B 場(chǎng)中的優(yōu)勢(shì)菌分別為厚壁菌門 （Firmicutes）、 擬桿菌門 （Bacteroidetes）、 變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體（Spirochaetes）等。 A 場(chǎng)和 B 場(chǎng)相比，梭桿菌門（Fusobacteria）在 A 場(chǎng)的樣本中被檢出，而螺旋體（Spirochaetes）僅在A 場(chǎng)的A_FR1、A_FR5 中檢出但豐度最高僅為1.74%。 B_FR1 中擬桿菌門的豐度為75.03%，在樣品中豐度值最高。 健康牛蹄部樣本中優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）；厚壁菌門（Firmicutes）在健康牛蹄部樣本中豐度均高于64.10%，其次為擬桿菌門（Bacteroidetes），且豐度均高于12.90%。 蹄部腐肉樣本于健康樣本相比，A 場(chǎng)的梭桿菌門（Fusobacteria）于B 場(chǎng)的螺旋體（Spirochaetes）豐度均高于健康樣本，見圖3。

圖3 樣本中細(xì)菌門分類水平的比較

2.4 在屬分類水平上的細(xì)菌組成

利用QIIME 軟件分析奶牛蹄部腐肉樣本和健康牛蹄部樣本在屬分類水平上豐度較高的前10 個(gè)物種。 結(jié)果如圖4， 在A 牛場(chǎng)奶牛蹄部腐肉樣本中優(yōu)勢(shì)菌群為梭桿菌屬 （Fusobacterium）、 卟啉單胞菌屬（Proteobacteria）； 在B 牛場(chǎng)中奶牛蹄部腐肉樣本中優(yōu)勢(shì)菌群為密螺旋體 （Treponema）、 卟啉單胞菌屬（Proteobacteria）；A 場(chǎng)和B 場(chǎng)奶牛蹄部腐肉樣本中的主要菌群分別為梭桿菌屬（Fusobacterium）、密螺旋體（Treponema）、卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）等。 在 A 場(chǎng)樣本中，A_FR1、A_FR2、A_FR3 中豐度最高的菌群為梭桿菌屬（Fusobacterium），分別占總細(xì)菌數(shù)的 15.04%、58.60%、16.93%，在 A_FR4、A_FR5 中，豐度最高的菌群為啉單胞菌屬 （Proteobacteria）， 分別占8.43%、9.11%。 不同于A 場(chǎng)，B 場(chǎng)中大量存在梭桿菌屬（Fusobacterium），而 A 場(chǎng)中大量存在密螺旋體（Treponema）。

圖4 細(xì)菌屬分類水平的比較

2.5 物種組成熱圖分析

使用平均豐度前10 位的屬的豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖。 結(jié)果如圖5 所示，熱圖橫、縱坐標(biāo)分別為不同樣本編號(hào)和豐度前10 的菌屬名稱。 圖中色塊顏色越深，代表樣本中該屬細(xì)菌豐度高于其他樣本；色塊顏色越淺，代表樣本中該屬細(xì)菌的豐度低于其他樣本。 結(jié)果顯示在屬水平上A 和B 兩牛場(chǎng)奶牛蹄皮炎樣本與健康牛蹄樣本前10 位物種的豐度差異較大。 梭桿菌屬（Fusobacterium）、密螺旋體（Treponema）與卟啉單胞菌屬 （Porphyromonas） 等在奶牛蹄皮炎樣本中豐度較高， 而費(fèi)克藍(lán)姆菌屬 （Facklamia）、 異位線蟲（Atopostipes）與厭氧球菌屬（Anaerococcus）豐度較高。

圖5 物種聚類的屬水平物種組成熱圖

3 討 論

奶牛蹄皮炎是一種細(xì)菌病[12]，可導(dǎo)致奶牛的跛行，引起炎癥反應(yīng)及皮膚損傷，使得奶牛在行走或站立時(shí)疼痛，進(jìn)而使得奶牛采食量下降和泌乳量降低等情況出現(xiàn)，造成經(jīng)濟(jì)損失。 Burger 等人研究表明，奶牛27%的經(jīng)濟(jì)虧損都是由蹄病造成的[13]。另有調(diào)查顯示，每頭患蹄皮炎的奶牛損失的總成本（治療成本、產(chǎn)奶量下降成本）為1990 元左右[14]。 現(xiàn)如今對(duì)奶牛蹄皮炎的病因及傳播機(jī)制尚不明確，但隨著基因測(cè)序等實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的發(fā)展，奶牛蹄皮炎的相關(guān)病原菌和疾病傳播機(jī)制也在慢慢被揭開。 曾有多位學(xué)者在本病樣本中分離出多種細(xì)菌，尤其是密螺旋體[15]。 此外，有報(bào)道稱本病相關(guān)細(xì)菌難以使用培養(yǎng)基培養(yǎng)，且難以建立感染模型[16～18]。 因此，本次研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)奶牛蹄皮炎樣本和健康奶牛蹄樣本進(jìn)行檢測(cè)，可對(duì)“無法培養(yǎng)”的微生物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)奶牛蹄病樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性。資料顯示，我國(guó)使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)奶牛蹄病的微生物多樣性檢測(cè)的案例很少。 在本試驗(yàn)中，提供了我國(guó)新疆地區(qū)牛場(chǎng)中蹄皮炎腐肉樣本中的數(shù)據(jù)信息，為將來對(duì)奶牛蹄病的防控措施的制定及治療時(shí)的藥物選擇提供了參考。 本次試驗(yàn)結(jié)果表明，患蹄病的奶牛蹄部腐肉處菌群多樣性在不同細(xì)菌分類水平均上升，蹄病腐肉中的菌群結(jié)構(gòu)更復(fù)雜。 王德海對(duì)齊齊哈爾市某規(guī)?；?chǎng)中奶牛蹄皮炎病原微生物多樣性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣本中優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）等，但未發(fā)現(xiàn)螺旋體（Spirochaetes）的存在，這一結(jié)果可能是因?yàn)椴煌貐^(qū)奶牛蹄皮炎的流行情況不同[19]。 本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，奶牛蹄皮炎中的菌門分布情況與大多數(shù)哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌門相似[20'21]，因此，部分奶牛蹄病的一些致病菌可能來自于奶牛腸道中的細(xì)菌。 如果及時(shí)清理牛場(chǎng)圈舍中的糞污，可能會(huì)減少牛蹄與致病菌的接觸時(shí)間，減少發(fā)病幾率。 但與腸道菌群不同的是，擬桿菌門（Bacteroidetes）的比例會(huì)上升，厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）的比例失調(diào)可能是引起蹄病的原因也可能是發(fā)生蹄病后的癥狀，還需要進(jìn)一步研究。

密螺旋體一直被認(rèn)為是導(dǎo)致奶牛患蹄皮炎的主要病原微生物， 并且在受感染的奶牛所在牛場(chǎng)的奶牛糞便及環(huán)境樣本中檢測(cè)到密螺旋體[15'22]。 本次實(shí)驗(yàn)中，在A、B 牛場(chǎng)均檢出螺旋體（Spirochaetes），試驗(yàn)結(jié)果與之相符。 A 牛場(chǎng)與B 牛場(chǎng)采集的奶牛蹄皮炎樣本中菌群分布有所差異，A 場(chǎng)和B 場(chǎng)相比，梭桿菌門（Fusobacteria）僅在A 場(chǎng)的樣本中被檢出，而螺旋體（Spirochaetes）僅在 A 場(chǎng)的 A_FR1、A_FR5中檢出但豐度最高僅為1.74%，可能是由于牛場(chǎng)環(huán)境不同，導(dǎo)致不同牛場(chǎng)中奶牛蹄部患處的細(xì)菌分布也存在差異。 A、B 兩牛場(chǎng)健康牛蹄部樣本的細(xì)菌分布與豐度相似， 該結(jié)果表明兩牛場(chǎng)中環(huán)境均分布情況相似。

奶牛蹄皮炎的發(fā)生與多種細(xì)菌有關(guān)。 在屬分類水平上，A 牛場(chǎng)中的梭桿菌屬（Fusobacterium）豐度上升，壞死梭桿菌屬于梭桿菌屬（Fusobacterium），該菌侵染力不強(qiáng)，但可以輕易的侵入受傷的皮膚組織，會(huì)使組織出現(xiàn)濃腫和腐臭氣味，這與先前在牛場(chǎng)采樣時(shí)患病奶牛癥狀相符，因此梭桿菌屬（Fusobacterium）豐度值的上升可能是部分蹄病的癥狀之一；B 牛場(chǎng)中的密螺旋體（Treponema）豐度值高于該場(chǎng)健康蹄部樣本，最高可達(dá)29.43%，有學(xué)者認(rèn)為，奶牛蹄皮炎是由密螺旋體導(dǎo)致的[15]，密螺旋體的豐度值的升高也與其相互驗(yàn)證。當(dāng)奶牛發(fā)生蹄皮炎時(shí)，菌群的多樣性降低，1 種或多種細(xì)菌的豐度增高。但在研究中發(fā)現(xiàn)，不同奶牛場(chǎng)中豐度增高的菌群存在差異，但厚壁菌屬起主導(dǎo)作用，可能與牛場(chǎng)環(huán)境有關(guān)。

4 結(jié) 論

奶?；继闫ぱ缀?，患處腐肉菌群多樣性及豐度明顯升高。 不同牛場(chǎng)蹄皮炎患處樣本中厚壁菌門豐度較高，但不同牛場(chǎng)中還有其它不同菌門上升。當(dāng)奶?；继闫ぱ缀蠡继幐饩菏д{(diào)，菌群結(jié)構(gòu)分布以及豐度變化與奶牛蹄皮炎的發(fā)生存在密切關(guān)聯(lián)。