楊 康，楊夷平，古麗巴哈·哈德?tīng)?，阿達(dá)來(lái)提·尤素甫，段進(jìn)剛，何 波，方先珍*

（1.哈密市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆 哈密 839000；2.伊州區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆 哈密 839000）

布魯氏菌?。˙rucellosis，簡(jiǎn)稱布?。┦怯刹剪斒暇鸬囊环N人畜共患病，對(duì)人和動(dòng)物的生殖、神經(jīng)和骨骼系統(tǒng)可以造成嚴(yán)重?fù)p害，在我國(guó)屬于二類動(dòng)物疫病。 動(dòng)物主要感染牛、羊、豬、狗，近幾年來(lái)在牛羊中流行呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)健康發(fā)展[1～3]。 因此，如何能快速、準(zhǔn)確的對(duì)該病進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，對(duì)做好該病的動(dòng)物疫病預(yù)防工作至關(guān)重要。目前，市場(chǎng)上流通的布病血清學(xué)檢測(cè)試劑盒種類較多，各有優(yōu)缺點(diǎn)：虎紅平板凝集試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，但試驗(yàn)結(jié)果受反應(yīng)溫度和時(shí)間的影響，不易判定，大多數(shù)下用于樣品的初篩；試管凝集試驗(yàn)是我國(guó)診斷布魯氏菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法操作起來(lái)繁瑣、復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，不易現(xiàn)場(chǎng)操作；熒光偏振試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短，準(zhǔn)確率高，是OIE 貿(mào)易規(guī)定的試驗(yàn)方法，但該方法使用的診斷儀器和診斷試劑費(fèi)用比較高；ELISA 試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、快速、樣品需求量小，但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)備要求比較高，不便在基層使用[4～6]。如何能結(jié)合實(shí)際情況，篩選出檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高、價(jià)格適宜、能指導(dǎo)生產(chǎn)的檢測(cè)試劑盒值得我們?nèi)ヌ接懪c研究。 本文針對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、熒光偏振試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)5 種常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行了比較分析，為今后開(kāi)展布魯氏菌病診斷技術(shù)提供了一定參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

收集哈密市域內(nèi)近幾年陸續(xù)送檢的未經(jīng)免疫的陽(yáng)性血清151 份，陰性血清21 份，總計(jì)172 份。

1.1.2 檢測(cè)試劑

布魯氏菌菌病虎紅抗原；試管凝集抗原、陰性血清、陽(yáng)性血清；ELISA 檢測(cè)試劑盒；熒光偏振檢測(cè)診斷試劑盒。

1.1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀；洗板機(jī)；恒溫培養(yǎng)箱；熒光偏振儀。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法

RBT、SAT 試驗(yàn)按照GB／T 18646-2018 動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)操作及結(jié)果判定；FPA 和ELISA 試驗(yàn)按照檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作及結(jié)果判定。

1.2.2 評(píng)價(jià)方法

在進(jìn)行不同的試驗(yàn)方法比較時(shí)，利用Excel 將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并形成表1，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。并參照該表計(jì)算出：敏感性=（A／P1）×100%、特異性=（D／N1）×100%、假陽(yáng)性率=（B／N1）×100%、假陰性率=（C／P1）×100%、一致性（符合率）=[（A＋D）／S]）×100%，用這些指標(biāo)比較不同診斷試劑的診斷效果[7]。

表1 診斷試驗(yàn)與參比試驗(yàn)結(jié)果比對(duì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)結(jié)果的比較

將收集的 172 份樣品，用 RBT、SAT、FPA、cELISA、iELISA 進(jìn)行檢測(cè)，并以國(guó)標(biāo) GB／T 18646-2018 中的SAT 檢測(cè)方法為參照，將各檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果錄入到Excel 表格中，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理得到表2。

表2 SAT 檢測(cè)結(jié)果與FPA、cELISA、iELISA 檢測(cè)結(jié)果的比較

續(xù)上表

2.2 不同診斷方法的效果評(píng)價(jià)

根據(jù)公式，計(jì)算出各診斷方法的一致性、敏感性與特異性，其中RBT 的敏感性最高，為100%；FPA 的特異性最高，為74.51%；FPA 的假陽(yáng)性率最低，為25.49%，RBT 的假陰性率最低，為0；各診斷試驗(yàn)的符合率由高到低依次為RBT、FPA、cELISA、iELISA，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同診斷方法的效果評(píng)價(jià)

2.3 SAT 與FPA 檢測(cè)靈敏度的比較

將購(gòu)自于哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清按照表5 中的比例進(jìn)行倍比稀釋，SAT 最高在血清稀釋度1∶1 600 可以檢測(cè)出陽(yáng)性，F(xiàn)PA 最高在血清稀釋度1∶3 200 可以檢測(cè)出陽(yáng)性，具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 SAT 與FPA 檢測(cè)靈敏度的比較

3 討 論

本文檢測(cè)的樣品主要來(lái)源于近幾年本市域內(nèi)未經(jīng)布病疫苗免疫的規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)、散養(yǎng)戶的羊群，其中陽(yáng)性血清151 份，陰性血清21 份，樣品送檢前進(jìn)行了RBT 初篩。本市布病凈化的手段主要是通過(guò)RBT 初篩，試管凝集確診。 經(jīng)過(guò)幾年的努力，本市動(dòng)物布魯氏菌病的整體陽(yáng)性率，已由2016 年的1.9%降至現(xiàn)在的0.4%[8]。

本次比較中發(fā)現(xiàn)，RBT 的符合率是這五種試驗(yàn)方法中最高的，為82.56%，其敏感性為100%，一致性高達(dá)82.56%，這也是RBT 一直被基層作為初篩的重要原因之一。 此外，RBT 操作簡(jiǎn)便，對(duì)技術(shù)人員要求不高，進(jìn)行簡(jiǎn)單培訓(xùn)，就可以操作，幾分鐘就可以出結(jié)果，比較適合進(jìn)行大批量樣品的檢測(cè)，但RBT 特異性比較低，因此該方法只適合樣品的初篩[9]。

SAT 是我國(guó)診斷布魯氏菌病的法定方法，所以本文以SAT 作為參考方法，該方法主要是檢測(cè)IgM，敏感性較高，常用于布魯氏菌病的早期診斷。 但SAT 單獨(dú)使用時(shí)特異性比較低，結(jié)果需要通過(guò)肉眼觀察來(lái)判定，受技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)影響比較大，不能區(qū)分自然感染和人工免疫。此外，SAT 試驗(yàn)周期比較長(zhǎng)，無(wú)法做到快速檢測(cè)，試驗(yàn)操作相對(duì)較為繁瑣，每個(gè)樣品要做4 個(gè)稀釋度，牛羊的血清稀釋倍數(shù)不統(tǒng)一，這些無(wú)疑增加了技術(shù)人員的工作量。 SAT 試驗(yàn)對(duì)溫度要求也比較高，要在37 ℃恒溫箱中反應(yīng)，不利于在田間或者沒(méi)有相關(guān)恒溫設(shè)備的基層實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，一般縣級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室才能開(kāi)展。

FPA 試驗(yàn)結(jié)果表明，其特異性和準(zhǔn)確率都比較高，不容易造成誤診。 FPA 試驗(yàn)整個(gè)操作過(guò)程比較簡(jiǎn)單，幾分鐘就可以得到檢測(cè)結(jié)果，不需要長(zhǎng)時(shí)間的等待和孵育、洗板、讀板等工作。 但FPA 試驗(yàn)需要指定的檢測(cè)儀器和檢測(cè)試劑，價(jià)格比較昂貴，不適合在檢測(cè)經(jīng)費(fèi)比較緊張、監(jiān)測(cè)數(shù)量比較多的區(qū)縣、鄉(xiāng)鎮(zhèn)推廣，但可以根據(jù)實(shí)際情況，結(jié)合其他檢測(cè)方法選擇性使用。 據(jù)了解，F(xiàn)PA 試驗(yàn)在貿(mào)易口岸使用較為常見(jiàn)[10，11]。

ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明，cELISA 和iELISA 都具有較高的敏感性。而且，ELISA 操作簡(jiǎn)單，樣本需求量不大，適合大批量檢測(cè)[12]。 我區(qū)作為布病檢疫凈化區(qū)，每年檢測(cè)數(shù)量都比較多，ELISA 檢測(cè)方法就比較適合。同時(shí)，ELISA 檢測(cè)結(jié)果比較客觀，不會(huì)受技術(shù)人員的主觀因素導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果各異。但各鄉(xiāng)鎮(zhèn)由于技術(shù)人員水平和設(shè)備條件限制，且ELISA 檢測(cè)的試劑費(fèi)用相對(duì)也比較貴，無(wú)法在鄉(xiāng)鎮(zhèn)一級(jí)推廣普及。

為了驗(yàn)證SAT 試驗(yàn)和FPA 試驗(yàn)的靈敏度， 本文將哈藥集團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清按比例進(jìn)行倍比稀釋，SAT 最高在血清稀釋度1∶1 600 可以檢測(cè)出陽(yáng)性，而FPA 在血清稀釋度1∶3 200 依然可以檢測(cè)出陽(yáng)性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)PA 的靈敏度更高。 這樣，在生產(chǎn)實(shí)踐中，F(xiàn)PA 可以作為補(bǔ)充試驗(yàn)，對(duì)SAT 檢測(cè)結(jié)果為陰性的情況下，可以使用FPA 進(jìn)行再次驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

綜上所述，布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，而且由于客觀條件的限制，每個(gè)層面的技術(shù)人員所能選擇檢測(cè)方法也比較局限，特別是越往基層，所能選擇的檢測(cè)方法越單一。這就導(dǎo)致很難對(duì)布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè)方法做出一個(gè)統(tǒng)一的選擇。綜合考慮，為了降低牛羊布魯氏菌病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)選取敏感性較高的檢測(cè)方法，如鄉(xiāng)鎮(zhèn)可以選擇RBT、市（區(qū)）縣可以選擇ELISA 等。 同時(shí)，為了減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失，與特異性較高的檢測(cè)方法結(jié)合使用，如市（區(qū)）縣可以選擇SAT、市級(jí)單位可以選擇SAT、FPA。 采用兩種以上檢測(cè)方法，不僅可以降低布魯氏菌病的傳播風(fēng)險(xiǎn)，減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失，還可以確保檢測(cè)出結(jié)果的準(zhǔn)確性，為檢疫凈化提供可靠保證。