楊 康,楊夷平,古麗巴哈·哈德?tīng)?,阿達(dá)來(lái)提·尤素甫,段進(jìn)剛,何 波,方先珍*
(1.哈密市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,新疆 哈密 839000;2.伊州區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,新疆 哈密 839000)
布魯氏菌?。˙rucellosis,簡(jiǎn)稱布?。┦怯刹剪斒暇鸬囊环N人畜共患病,對(duì)人和動(dòng)物的生殖、神經(jīng)和骨骼系統(tǒng)可以造成嚴(yán)重?fù)p害,在我國(guó)屬于二類動(dòng)物疫病。 動(dòng)物主要感染牛、羊、豬、狗,近幾年來(lái)在牛羊中流行呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì),嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)健康發(fā)展[1~3]。 因此,如何能快速、準(zhǔn)確的對(duì)該病進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),對(duì)做好該病的動(dòng)物疫病預(yù)防工作至關(guān)重要。目前,市場(chǎng)上流通的布病血清學(xué)檢測(cè)試劑盒種類較多,各有優(yōu)缺點(diǎn):虎紅平板凝集試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,但試驗(yàn)結(jié)果受反應(yīng)溫度和時(shí)間的影響,不易判定,大多數(shù)下用于樣品的初篩;試管凝集試驗(yàn)是我國(guó)診斷布魯氏菌病的金標(biāo)準(zhǔn),但該方法操作起來(lái)繁瑣、復(fù)雜、費(fèi)時(shí),不易現(xiàn)場(chǎng)操作;熒光偏振試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短,準(zhǔn)確率高,是OIE 貿(mào)易規(guī)定的試驗(yàn)方法,但該方法使用的診斷儀器和診斷試劑費(fèi)用比較高;ELISA 試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、快速、樣品需求量小,但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)備要求比較高,不便在基層使用[4~6]。如何能結(jié)合實(shí)際情況,篩選出檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高、價(jià)格適宜、能指導(dǎo)生產(chǎn)的檢測(cè)試劑盒值得我們?nèi)ヌ接懪c研究。 本文針對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、熒光偏振試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)5 種常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行了比較分析,為今后開(kāi)展布魯氏菌病診斷技術(shù)提供了一定參考價(jià)值。
1.1.1 樣本
收集哈密市域內(nèi)近幾年陸續(xù)送檢的未經(jīng)免疫的陽(yáng)性血清151 份,陰性血清21 份,總計(jì)172 份。
1.1.2 檢測(cè)試劑
布魯氏菌菌病虎紅抗原;試管凝集抗原、陰性血清、陽(yáng)性血清;ELISA 檢測(cè)試劑盒;熒光偏振檢測(cè)診斷試劑盒。
1.1.3 主要儀器
酶標(biāo)儀;洗板機(jī);恒溫培養(yǎng)箱;熒光偏振儀。
1.2.1 檢測(cè)方法
RBT、SAT 試驗(yàn)按照GB/T 18646-2018 動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)操作及結(jié)果判定;FPA 和ELISA 試驗(yàn)按照檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作及結(jié)果判定。
1.2.2 評(píng)價(jià)方法
在進(jìn)行不同的試驗(yàn)方法比較時(shí),利用Excel 將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并形成表1,對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。并參照該表計(jì)算出:敏感性=(A/P1)×100%、特異性=(D/N1)×100%、假陽(yáng)性率=(B/N1)×100%、假陰性率=(C/P1)×100%、一致性(符合率)=[(A+D)/S])×100%,用這些指標(biāo)比較不同診斷試劑的診斷效果[7]。
表1 診斷試驗(yàn)與參比試驗(yàn)結(jié)果比對(duì)表
將收集的 172 份樣品,用 RBT、SAT、FPA、cELISA、iELISA 進(jìn)行檢測(cè),并以國(guó)標(biāo) GB/T 18646-2018 中的SAT 檢測(cè)方法為參照,將各檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果錄入到Excel 表格中,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理得到表2。
表2 SAT 檢測(cè)結(jié)果與FPA、cELISA、iELISA 檢測(cè)結(jié)果的比較
續(xù)上表
根據(jù)公式,計(jì)算出各診斷方法的一致性、敏感性與特異性,其中RBT 的敏感性最高,為100%;FPA 的特異性最高,為74.51%;FPA 的假陽(yáng)性率最低,為25.49%,RBT 的假陰性率最低,為0;各診斷試驗(yàn)的符合率由高到低依次為RBT、FPA、cELISA、iELISA,具體結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 不同診斷方法的效果評(píng)價(jià)
將購(gòu)自于哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清按照表5 中的比例進(jìn)行倍比稀釋,SAT 最高在血清稀釋度1∶1 600 可以檢測(cè)出陽(yáng)性,F(xiàn)PA 最高在血清稀釋度1∶3 200 可以檢測(cè)出陽(yáng)性,具體結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 SAT 與FPA 檢測(cè)靈敏度的比較
本文檢測(cè)的樣品主要來(lái)源于近幾年本市域內(nèi)未經(jīng)布病疫苗免疫的規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)、散養(yǎng)戶的羊群,其中陽(yáng)性血清151 份,陰性血清21 份,樣品送檢前進(jìn)行了RBT 初篩。本市布病凈化的手段主要是通過(guò)RBT 初篩,試管凝集確診。 經(jīng)過(guò)幾年的努力,本市動(dòng)物布魯氏菌病的整體陽(yáng)性率,已由2016 年的1.9%降至現(xiàn)在的0.4%[8]。
本次比較中發(fā)現(xiàn),RBT 的符合率是這五種試驗(yàn)方法中最高的,為82.56%,其敏感性為100%,一致性高達(dá)82.56%,這也是RBT 一直被基層作為初篩的重要原因之一。 此外,RBT 操作簡(jiǎn)便,對(duì)技術(shù)人員要求不高,進(jìn)行簡(jiǎn)單培訓(xùn),就可以操作,幾分鐘就可以出結(jié)果,比較適合進(jìn)行大批量樣品的檢測(cè),但RBT 特異性比較低,因此該方法只適合樣品的初篩[9]。
SAT 是我國(guó)診斷布魯氏菌病的法定方法,所以本文以SAT 作為參考方法,該方法主要是檢測(cè)IgM,敏感性較高,常用于布魯氏菌病的早期診斷。 但SAT 單獨(dú)使用時(shí)特異性比較低,結(jié)果需要通過(guò)肉眼觀察來(lái)判定,受技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)影響比較大,不能區(qū)分自然感染和人工免疫。此外,SAT 試驗(yàn)周期比較長(zhǎng),無(wú)法做到快速檢測(cè),試驗(yàn)操作相對(duì)較為繁瑣,每個(gè)樣品要做4 個(gè)稀釋度,牛羊的血清稀釋倍數(shù)不統(tǒng)一,這些無(wú)疑增加了技術(shù)人員的工作量。 SAT 試驗(yàn)對(duì)溫度要求也比較高,要在37 ℃恒溫箱中反應(yīng),不利于在田間或者沒(méi)有相關(guān)恒溫設(shè)備的基層實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展,一般縣級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室才能開(kāi)展。
FPA 試驗(yàn)結(jié)果表明,其特異性和準(zhǔn)確率都比較高,不容易造成誤診。 FPA 試驗(yàn)整個(gè)操作過(guò)程比較簡(jiǎn)單,幾分鐘就可以得到檢測(cè)結(jié)果,不需要長(zhǎng)時(shí)間的等待和孵育、洗板、讀板等工作。 但FPA 試驗(yàn)需要指定的檢測(cè)儀器和檢測(cè)試劑,價(jià)格比較昂貴,不適合在檢測(cè)經(jīng)費(fèi)比較緊張、監(jiān)測(cè)數(shù)量比較多的區(qū)縣、鄉(xiāng)鎮(zhèn)推廣,但可以根據(jù)實(shí)際情況,結(jié)合其他檢測(cè)方法選擇性使用。 據(jù)了解,F(xiàn)PA 試驗(yàn)在貿(mào)易口岸使用較為常見(jiàn)[10,11]。
ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明,cELISA 和iELISA 都具有較高的敏感性。而且,ELISA 操作簡(jiǎn)單,樣本需求量不大,適合大批量檢測(cè)[12]。 我區(qū)作為布病檢疫凈化區(qū),每年檢測(cè)數(shù)量都比較多,ELISA 檢測(cè)方法就比較適合。同時(shí),ELISA 檢測(cè)結(jié)果比較客觀,不會(huì)受技術(shù)人員的主觀因素導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果各異。但各鄉(xiāng)鎮(zhèn)由于技術(shù)人員水平和設(shè)備條件限制,且ELISA 檢測(cè)的試劑費(fèi)用相對(duì)也比較貴,無(wú)法在鄉(xiāng)鎮(zhèn)一級(jí)推廣普及。
為了驗(yàn)證SAT 試驗(yàn)和FPA 試驗(yàn)的靈敏度, 本文將哈藥集團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清按比例進(jìn)行倍比稀釋,SAT 最高在血清稀釋度1∶1 600 可以檢測(cè)出陽(yáng)性,而FPA 在血清稀釋度1∶3 200 依然可以檢測(cè)出陽(yáng)性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,F(xiàn)PA 的靈敏度更高。 這樣,在生產(chǎn)實(shí)踐中,F(xiàn)PA 可以作為補(bǔ)充試驗(yàn),對(duì)SAT 檢測(cè)結(jié)果為陰性的情況下,可以使用FPA 進(jìn)行再次驗(yàn)證。
綜上所述,布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn),而且由于客觀條件的限制,每個(gè)層面的技術(shù)人員所能選擇檢測(cè)方法也比較局限,特別是越往基層,所能選擇的檢測(cè)方法越單一。這就導(dǎo)致很難對(duì)布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè)方法做出一個(gè)統(tǒng)一的選擇。綜合考慮,為了降低牛羊布魯氏菌病傳播的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)選取敏感性較高的檢測(cè)方法,如鄉(xiāng)鎮(zhèn)可以選擇RBT、市(區(qū))縣可以選擇ELISA 等。 同時(shí),為了減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失,與特異性較高的檢測(cè)方法結(jié)合使用,如市(區(qū))縣可以選擇SAT、市級(jí)單位可以選擇SAT、FPA。 采用兩種以上檢測(cè)方法,不僅可以降低布魯氏菌病的傳播風(fēng)險(xiǎn),減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失,還可以確保檢測(cè)出結(jié)果的準(zhǔn)確性,為檢疫凈化提供可靠保證。