霍浩然，秦瑞峰，薛佳棟，袁增江

邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001

近年來，隨著人們健康意識的提高及預(yù)防幽門螺桿菌根除等措施的實(shí)施，胃癌發(fā)病率和致死率呈下降趨勢，但仍居惡性腫瘤致死率的第三位，僅次于肺癌和肝癌［1］。

川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是存在于川芎、溫莪術(shù)等植物根莖中的一種活性生物堿，化學(xué)名2，3，5，6-四甲基吡嗪，具有較為廣泛的抗腫瘤活性，已證實(shí)TMP對肺癌［2］、肝癌［3］、腎癌［4］等具有抑制作用，病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TMP的抑癌作用可能與促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡與自噬有關(guān)。磷脂酰肌醇3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是調(diào)控細(xì)胞凋亡自噬的關(guān)鍵信號通路［5］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究TMP對胃癌細(xì)胞凋亡和自噬的影響以及PI3K/Akt/mTOR通路所發(fā)揮的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人胃癌SGC-7901細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所（編號：SCSP-573）。

1.2 藥物及試劑磷酸川芎嗪注射液（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：20191219）；PI3K特異性抑制劑LY294002、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑（tetramethylazoazole，MTT）（美 國Sigma公 司，批 號：L9908、302A035、C208A）；DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號：AE20005267）；0.25%胰酶、胎牛血清（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：20190416、20190504）；Annexin V-FITC/PI試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號：C1063）；兔抗鼠磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷 酸 化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、β-actin單克隆抗體和山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號190130、190425、190319、190508、181204、190426、190131、190511）；DAB顯色試劑盒（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：20190327）。

1.3 儀器HF240型細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器公司）；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國Becton Dicknson公司）；5427R型低溫高速離心機(jī)（德國Eppendrof公司）；BX53型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；SE300型蛋白質(zhì)電泳儀（美國Hoefer公司）；DYCZ-40D型電泳槽（北京六一儀器廠）；Power-pac 3000型轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；VARIOSKANLUX型多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用SGC-7901細(xì)胞解凍復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置5%二氧化碳、恒溫37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度約80%時進(jìn)行傳代；取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)空白對照組（DMSO）、TMP（200、400、800 μg/mL）［6］和LY2940025 μg/mL［7］干預(yù)組。

1.4.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/mL，200 μL/孔接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，分別以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)10個復(fù)孔，48 h后20 μL/孔加入濃度5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，150 μL/孔加入DMSO室溫避光震蕩至結(jié)晶完全溶解后，通過酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度值（OD490nm）。

細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD490nm/空白對照組OD490nm）×100%

1.4.3 細(xì)胞凋亡水平檢測取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/mL，200 μL/孔接種于培養(yǎng)皿（內(nèi)置消毒玻片），培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)基，分別以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)10個培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后0.25%胰酶消化、離心半徑10 cm，1500 r/min離心5 min后棄上清，經(jīng)PBS溶液洗滌3次后，嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明進(jìn)行操作，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平并計算凋亡率。

1.4.4 細(xì)胞自噬水平檢測取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，200 μL/孔接種于24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，分別以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)10個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液并用PBS溶液洗滌3次，500 μL/孔滴加濃度為1 mg/L的吖啶橙溶液避光孵育15 min，PBS溶液洗滌3次后通過熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4.5 細(xì)胞蛋白表達(dá)水平檢測取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/mL，200 μL/孔接種于培養(yǎng)皿（內(nèi)置消毒玻片），培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)基，分別以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)10個培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后0.25%胰酶消化、離心半徑10 cm，1500 r/min離心5 min后棄上清取細(xì)胞，于冰上裂解細(xì)胞后4℃、離心半徑10 cm，12 000 r/min離心15 min去上清，BCA法測定總蛋白濃度后行沸水浴變性，取40 μg總蛋白量上樣、行SDS-PAGE凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，滴加p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、LC3、β-actin一抗后4℃孵育過夜，PBS溶液洗滌3伺候滴加二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加DAB顯色劑；以β-actin為內(nèi)參，通過條帶灰度值半定量蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡的影響與空白對照組比較，TMP（200、400、800 μg/mL）組和LY294002 5 μg/mL組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與LY294002 5 μg/mL組比較，TMP 800 μg/mL組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖1—3。

圖1 TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2 TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞自噬的影響紅色熒光為陽性著色，表示自噬溶酶體。與空白對照組比較，TMP 200、400、800 μg/mL組和LY2940025 μg/mL組紅色熒光呈不同程度增多，并且TMP作用呈現(xiàn)一定劑量依賴性，提示SGC-7901細(xì)胞經(jīng)TMP或LY294002干預(yù)后自噬溶酶體明顯增多，即TMP具有誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞自噬的作用。見圖4。

圖2 TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

圖3 TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響

圖4 熒光顯微鏡下TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞自噬的影響

2.3 TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞p-PI3K、p-Akt、pmTOR蛋白表達(dá)的影響與空白對照組比較，TMP 400、800 μg/mL組和LY294002 5 μg/mL組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR相 對 表 達(dá) 量 明 顯 降 低（P＜0.05）；與LY294002 5 μg/mL組比較，TMP 800 μg/mL組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響

2.4 TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響與空白對照組比較，TMP 400、800 μg/mL組和LY294002 5 μg/mL組Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9相對表達(dá)量明顯提高（P＜0.05）；與LY294002 5 μg/mL組比較，TMP 800 μg/mL組Cleaved Caspase-3相對表達(dá)量明顯提高（P＜0.01）。見圖6。

圖6 TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

2.5 TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-I比值的影響與空白對照組比較，TMP 400、800 μg/mL組和LY294002 5 μg/mL組LC3-Ⅱ、LC3-I相對表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值明顯提高（P＜0.01）；與LY294002 5μg/mL組比較，TMP 800 μg/mL組LC3-Ⅱ、LC3-I相對表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值明顯提高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 TMP對人胃癌SGC-7901細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-I比值的影響

3 討論

胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，每年新發(fā)病例約100萬，每年病死人數(shù)約74萬［8］。中醫(yī)藥抗腫瘤有獨(dú)到的理論體系與診療優(yōu)勢［9］，胃癌屬中醫(yī)“噎膈”“積聚”等范疇，其病機(jī)主要在于脾胃虛寒、瘀毒內(nèi)阻、氣血雙虧所致胃脘氣滯食積、痰凝血瘀、結(jié)而成積。

中藥川芎是主產(chǎn)于我國四川省、云南省、貴州省等地的一種傘形科蒿本屬植物，它辛溫香燥，《日華子本草》記載其“上行可達(dá)巔頂、下行可達(dá)血?！薄爸我磺酗L(fēng)、一切氣、一切勞損、一切血，排膿消瘀血”，具有廣泛的活血祛瘀功效。中藥川芎的主要活性成分TMP是一種吡嗪生物堿，既往文獻(xiàn)［10］報道TMP可干預(yù)細(xì)胞凋亡自噬而抑制腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)，TMP可明顯抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡和自噬，并且800 μg/mL TMP組對SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的效應(yīng)優(yōu)于LY294002組，提示TMP可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡和自噬。

細(xì)胞凋亡和自噬是細(xì)胞兩條程序化死亡途徑，二者可作為抗癌治療的靶點(diǎn)［11］。因腫瘤局部環(huán)境缺氧、Ca2+過載等將導(dǎo)致線粒體膜孔道開放度異常升高，致使線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C（cytochrome c，Cyt C）、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）等釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，二者能夠陸續(xù)活化Caspase-9、Caspase-3蛋白，其中Caspase-3可剪切破壞核酸、膜蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白等分子結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。LC3是細(xì)胞自噬的標(biāo)志性蛋白，分為無生理活性的LC3-Ⅰ亞型和有促細(xì)胞自噬活性的LC3-Ⅱ亞型。文獻(xiàn)［12］報道顯示，自噬狀態(tài)下無活性的LC3-Ⅰ可酶解一段多肽而成為有自噬活性的LC3-Ⅱ，所以LC3-Ⅱ/LC3-I比值可體現(xiàn)細(xì)胞自噬狀況。

Akt為PI3K下游靶基因，其表達(dá)與活化受PI3K調(diào)控。p-PI3K、p-Akt為二者活化狀態(tài)，p-Akt可間接抑制Caspase-3活化而抑制細(xì)胞凋亡［13］。mTOR是調(diào)控細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白，p-mTOR為其活化狀態(tài)，有文獻(xiàn)［14］報道p-mTOR可清除泛素蛋白而阻礙細(xì)胞自噬進(jìn)程，而mTOR磷酸化過程受p-Akt調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，給藥干預(yù)PI3K/Akt/mTOR通路活化可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡和自噬。本研究發(fā)現(xiàn)，TMP可明顯降低SGC-7901細(xì)胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR相對表達(dá)量，提高Cleaved Caspase-3、Caspase-9、LC3-Ⅱ相對表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值［15］；除Caspase-9外，800 μg/mL TMP組對其他蛋白表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的效應(yīng)優(yōu)于LY294002組，提示TMP促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡和自噬的作用可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化有關(guān)。

綜上所述，TMP可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化而誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡和自噬，本研究結(jié)果為TMP做為胃癌治療藥物提供了理論依據(jù)。