龔玉愛 舒誠榮 韓琦 郭宗華(咸寧市中心醫(yī)院 湖北科技學院附屬第一醫(yī)院 腫瘤科,湖北 咸寧 43700; 泌尿外科)

美國2019年有80 470 例膀胱癌患者,其中因膀胱癌死亡的人數(shù)為17 670 例〔1〕,因此找到有助于治療膀胱癌的藥品具有重要意義。艾迪注射液是含有斑蝥、人參、黃芪和刺五加等成分的中藥制劑,能通過提高人的免疫力來抑制腫瘤生長的功能,常作為癌癥化療中的輔助藥物。目前,相關研究已經(jīng)證明艾迪注射液能顯著提高乳腺癌〔2〕、肺癌〔3,4〕病人的總體緩解率,且艾迪注射液在中國也已廣泛應用于乳腺癌的治療。微小RNA(miRNA)是長度為22～25 個核苷酸的微小RNA 分子。絕大多數(shù)都與癌癥的發(fā)展過程有關。miR-126 在膀胱癌中是一種腫瘤抑制因子,有研究表明過表達miR-126 會減弱了膀胱癌細胞的侵襲能力,抑制miR-126 促進膀胱癌的細胞增殖、遷移和侵襲〔5,6〕,但miR-126 與艾迪注射液共同作用對膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響還未見報道。本研究探究艾迪注射液通過靶向miR-126 對膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 艾迪注射液購自貴州益佰制藥股份有限公司(359506),膀胱癌細胞T24 購自中國科學院上海細胞研究所,杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)購自上海微科生物技術有限公司,青霉素和鏈霉素購自上海生工公司,miR-mimics-NC、miR-126 mimics、miR-inhibitor-NC、miR-126 inhibitor 購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司,脂質體Lipofectamin 2000 轉染試劑購自美國Invitrogen 公司,胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco 公司,膜連蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司,TB Green Premix Ex-Taq 試劑盒購自日本Takara 公司;β-actin、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、P21、B 細胞淋巴瘤(Bcl)-2 和Bcl-2 相關X 蛋白(Bax)抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司,辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam 公司,RIPA 蛋白裂解液購自上海研謹生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組 將膀胱癌細胞T24 接種于在DMEM 培養(yǎng)基中,加入10%的胎牛血清和1%的青霉素/鏈霉素,放在37℃的5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對數(shù)期的T24 細胞,用胰蛋白酶消化傳代后分別用40、60、80 mg/ml 的艾迪注射液處理,分別記為Aidi-40 組、Aidi-60 組、Aidi-80 組;轉染miR-mimics-NC、miR-126 mimics 載體到T24 細胞,分別記為miR-mimics-NC 組,miR-126 mimics 組;用80 mg/ml 艾迪注射液處理,同時將miR-inhibitor-NC、miR-126 inhibitor 載體轉染到T24 細胞,分別記為Aidi-80+miR-inhibitor-NC組、Aidi-80+miR-126 inhibitor 組。

1.2.2 CCK-8 檢測T24 細胞增殖能力 取對數(shù)生長的T24 細胞消化后接種于96 孔板中,每孔50 000個細胞,按照1.2.1 分組干預48 h 后,換新鮮培養(yǎng)液,同時每個孔加入CCK-8(10 μl),放置于37℃的5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,然后用酶標儀測定450 nm 處的吸光值。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數(shù)生長的T24 細胞消化后制備成單細胞懸液,按照1.2.1的方法描述分組干預后,用Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒檢測各組細胞凋亡率,首先離心收集細胞,加入200 μl 結合緩沖液制備細胞懸液,然后加入10 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI,室溫下避光標記10 min后上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 qRT-PCR 分析miR-126 的表達水平 提取各組細胞總RNA,利用微量分光光度計測定RNA濃度,定量1 μg RNA 反轉錄為cDNA,然后利用熒光定量PCR 技術檢測miR-126 的相對表達水平。miR-126 的上游引物序列為:5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′, 下游: 5′-CATTATTACTTTTGGTACGCG-3′,U6 上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,GAPDH 的上游引物序列:5′-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3′,下游:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′引物由上海生工公司合成,qPCR 程序為95℃5 min;95℃10 s,60℃10 s,72℃31 s,40 個循環(huán)。

1.2.5 Western 印跡分析細胞內(nèi)的蛋白水平 收集各組細胞提取總蛋白,制備十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)不連續(xù)垂直電泳分離各個蛋白,然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂牛奶封閉非特異性結合位點、一抗孵育、二抗孵育后加入電化學發(fā)光(ECL)進行顯色反應。利用Quantity one 對條帶進行灰度分析,本實驗所用的參考蛋白為β-actin,數(shù)據(jù)處理時目標蛋白與β-actin灰度值的比值作為目標蛋白的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0 軟件進行單因素方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1 艾迪注射液對膀胱癌細胞T24 增殖的影響與NC 組相比,Andi-40、Andi-60、Andi-80 組能顯著抑制細胞T24 的增殖速度,且隨著劑量的增加,抑制效果更顯著(P＜0.05);CyclinD1 蛋白的表達顯著降低,P21 蛋白的表達顯著升高(P＜0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組增殖相關蛋白表達

2.2 艾迪注射液對膀胱癌細胞T24 凋亡的影響與NC 組相比,Aidi-40、Aidi-60 和Aidi-80 組凋亡率顯著升高,且呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.05);Bcl-2 的表達顯著降低,Bax 的表達顯著升高,同樣呈劑量依賴性(P＜0.05)。見表1、圖2、圖3。

圖2 各組凋亡相關蛋白表達

圖3 流式細胞術檢測各組凋亡率

表1 艾迪注射液對膀胱癌細胞T24 增殖和凋亡的影響(±s,n=9)

表1 艾迪注射液對膀胱癌細胞T24 增殖和凋亡的影響(±s,n=9)

與NC 組比較:1)P＜0.05

組別OD(490 nm)CyclinD1P21凋亡率(%)Bcl-2BaxmiR-126 NC 組1.08±0.021.07±0.031.01±0.038.58±1.261.10±0.030.99±0.020.96±0.02 Aidi-40 組0.83±0.021)0.81±0.021)1.44±0.031)14.58±2.241)0.79±0.021)1.42±0.031)1.35±0.031)Aidi-60 組0.58±0.021)0.61±0.021)1.67±0.031)17.23±2.471)0.59±0.021)1.70±0.031)1.68±0.031)Aidi-80 組0.40±0.011)0.36±0.021)1.91±0.041)19.91±2.151)0.34±0.011)2.12±0.041)2.05±0.031)F/P 值176.000/0.000 224.000/0.000 267.100/0.000 224.700/0.000 174.400/0.000 317.300/0.000 316.700/0.000

2.3 艾迪注射液對膀胱癌細胞T24 中miR-126 表達的影響 與NC 組相比,Aidi-40、Aidi-60 和Aidi-80 組miR-126 的表達水平顯著上升,且呈劑量依賴性(P＜0.05)。見表1。

2.4 過表達miR-126 對膀胱癌細胞T24 增殖和凋亡的影響 與miR-mimics-NC 組相比,miR-126 mimics 組的miR-126 表達水平顯著升高,細胞增殖速率顯著下降,凋亡率顯著升高,CyclinD1 和Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低,P21 和Bax 蛋白的表達水平顯著升高(P＜0.05)。見圖4、圖5、表2。

圖4 Western 印跡檢測各組凋亡相關蛋白

圖5 流式細胞術檢測兩組凋亡率

表2 過表達miR-126 對膀胱癌細胞T24 增殖和凋亡的影響(±s,n=9)

表2 過表達miR-126 對膀胱癌細胞T24 增殖和凋亡的影響(±s,n=9)

組別miR-126OD 490 nmCyclinD1P21凋亡率(%)Bcl-2Bax miR-mimics-NC 組1.11±0.021.08±0.021.00±0.020.98±0.039.1 1±0.181.04±0.031.03±0.02 miR-126 mimics 組1.74±0.030.63±0.030.47±0.031.63±0.0218.60±0.280.47±0.031.65±0.03 t/P 值17.240/0.00014.120/0.00015.850/0.00018.310/0.00028.920/0.00014.880/0.00017.860/0.000

2.5 沉默miR-126 能逆轉艾迪注射液對膀胱癌細胞T24 增殖和凋亡的影響 與Aidi-80+miR-inhibitor-NC 組相比,Aidi-80+miR-126 inhibitor 組的T24細胞增殖速率顯著升高,凋亡率顯著下降,CyclinD1和Bcl-2 蛋白的表達量顯著升高,P21 和Bax 蛋白的表達量顯著降低(P＜0.05)。見表3、圖6、圖7。

表3 沉默miR-126 能逆轉艾迪注射液對膀胱癌細胞T24 增殖和凋亡的影響(±s,n=9)

表3 沉默miR-126 能逆轉艾迪注射液對膀胱癌細胞T24 增殖和凋亡的影響(±s,n=9)

組別miR-126OD 490 nmCyclinD1P21凋亡率(%)Bcl-2Bax Aidi-80+miR-inhibitor-NC 組 1.99±0.030.38±0.030.46±0.021.85±0.0323.67±0.360.46±0.032.02±0.03 Aidi-80+miR-126inhibitor 組 1.39±0.020.79±0.020.88±0.021.34±0.0215.63±0.250.81±0.021.49±0.03 t/P 值18.340/0.000 10.900/0.000 16.850/0.000 15.560/0.000 18.320/0.000 9.944/0.000 13.570/0.000

圖6 凋亡相關蛋白

圖7 流式細胞術檢測兩組凋亡率

3 討 論

中草藥現(xiàn)在已廣泛應用于癌癥治療,是輔助癌癥治療的重要方式之一。艾迪注射液是提取5 種中草藥成分制成的藥劑。已有報道說明其在多種癌癥治療中發(fā)揮作用,Xie 等〔7〕發(fā)現(xiàn)與單獨化療相比,艾迪注射液與化療藥物同步使用可以降低化學療法對肝腎功能,骨髓抑制和胃腸道反應的損害發(fā)生率;Xiao 等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)艾迪注射液可以減輕紫杉醇類化療對非小細胞肺癌患者的血液毒性;Shi 等〔9〕研究結果顯示艾迪注射液可以通過抑制EMT 信號傳導和血管形成來抑制食管鱗狀細胞癌的腫瘤轉移;Liu 等〔10〕發(fā)現(xiàn)艾迪注射液聯(lián)合西藥治療能改善原發(fā)性肝癌患者的臨床癥狀;Li 等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)艾迪注射液聯(lián)合FOLFOX4 的療效比單獨接受FOLFOX4 方案治療的療效好,而且能改善不良反應。本研究結果表明艾迪注射液能顯著抑制膀胱癌細胞T24 的增殖,促進其凋亡,且隨著劑量的增加,效果更明顯。

研究表明miRNA 能參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,如細胞增殖、分化、凋亡、自噬及損傷等,同時也發(fā)現(xiàn)了很多miRNA 的異常表達會導致組織的癌變。miR-126 在很多癌癥中都起著抑癌作用,在癌變組織和細胞中下調表達,如胃癌〔12〕、非小細胞肺癌〔13〕、大腸癌〔14〕、結腸癌〔15〕等,已有研究報道m(xù)iR-126 在膀胱癌中同樣起著抑癌作用〔5,6〕。本研究結果說明在艾迪注射液的處理下,膀胱癌細胞T24 中miR-126的表達水平上調,且隨著艾迪注射液濃度的增加,miR-126 的表達水平也隨梯度升高,另外發(fā)現(xiàn)沉默miR-126 能逆轉艾迪注射液對膀胱癌細胞T24 增殖和凋亡的影響,進一步說明艾迪注射液可能是通過調控miR-126 來抑制膀胱癌細胞增殖,促進其凋亡的。

綜上所述,艾迪注射液可能是通過靶向正調控miR-126 來抑制膀胱癌細胞增殖,促進其凋亡。