王建宇 高倩 張莉 王勇朝 崔永健 魏琰 (衡水市人民醫(yī)院神內二科,河北 衡水 053000)

缺血性腦卒中表現(xiàn)為高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的三高特點,給社會和患者家庭造成極大的精神及經濟壓力〔1～3〕。正常大腦的血管被堵塞后,造成血液供應被中斷,進而造成局部腦組織缺血缺氧,最終導致腦細胞的壞死或凋亡等〔4,5〕,即使在一定時間內血液供應得以恢復,但大腦的功能卻不能得到及時的恢復,反而會加重腦神經的功能障礙,即腦缺血再灌注損傷〔6,7〕。目前,針對缺血性腦卒中仍沒有十分有效的治療方案,近年來,藥物性保護成為臨床醫(yī)學關注的治療方案之一〔8～10〕。

紅景天苷是來源于紅景天的一種有效的生物活性成分,是我國十分珍貴的傳統(tǒng)中藥之一,擁有悠久的藥用歷史〔11～13〕。研究表明,其具有抗氧化作用,可抑制腦缺血再灌注后的炎癥反應,改善缺血再灌注后的神經功能缺陷,對腦組織發(fā)揮保護作用〔14～16〕。紅景天苷對小鼠腦缺血和脊髓損傷均具有保護作用,并且這種保護作用的機制是通過調控小膠質細胞的偏振分化而發(fā)揮作用〔17,18〕。腦缺血再灌注后紅景天苷對腦組織的保護機制鮮有報道,因此本文通過建立小鼠大腦中動脈缺血再灌注模型,觀察紅景天苷對腦組織的保護作用,并對其可能的作用機制進行探討。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8～12 周齡SPF 級C57/BL6 小鼠(22±25 g) 購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 藥品與試劑 紅景天苷由河北中醫(yī)藥科學院提供,純度大于95%;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自Sigma (T8877);動物組織總RNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司;DP431);cDNA 第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司;KR103-03);SYBR Green(天根生化科技有限公司;FP209);B 淋巴細胞瘤(Bcl)-2 抗體(CST 15071);Bcl-2 相關X 蛋白(Bax)抗體(CST 14796);cleaved-半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3 抗體(CST 9664);神經元核抗原(Neun)抗體(CST 12943);細胞色素(Cytochrome)C 凋亡檢測試劑盒(Biovision K257-100);TUNEL 凋亡檢測試劑盒(Roche 11684817910)。

1.1.3 儀器 冰凍切片機(Leica CM1950);線栓(Doccol,602156PK5Re);激光多普勒血流儀(Peri-Flux5001);通用型小動物麻醉機(瑞沃德R500);體溫維持儀(瑞沃德69020);體視顯微鏡(Olympus SZX7);激光掃描共聚焦顯微鏡 (Olympus,FV3000);熒光定量PCR 儀(ABI 7500).

1.2 實驗分組 為篩選出紅景天苷的最佳劑量,兩大組實驗被設計。實驗一:大腦中動脈阻塞60 min再灌注后,分別通過尾靜脈注射不同劑量的紅景天苷〔2.5,5.0,10.0,20.0 mg/(kg·d)〕及同體積的磷酸鹽緩沖液(PBS),連續(xù)注射3 d。第3 天進行神經功能缺陷評分,根據(jù)評分結果篩選出紅景天苷的最佳劑量。實驗二:實驗分為假手術(Sham)組、MCAO+Vehicle 組、MCAO+Sal 組,再灌注后及時通過尾靜脈注射紅景天苷,Sham 組和MCAO + Vehicle組注射相同體積的PBS。

1.3 MCAO 模型制作 氣體麻醉后,固定于加熱板上,使小鼠體溫維持在(37±0.5)℃,立體顯微鏡下,在頸部中間剪一小口,鈍性分離肌肉,暴露出左側頸總動脈(CCA),鈍性分離并打活結,繼續(xù)往內上方分離出頸外動脈(ECA),遠心端打死結,近心端打活結,外下方分離出頸內動脈(ICA),用動脈夾夾閉,在頸外動脈的近心端與遠心端中間處剪一小口,將線栓從此處插入頸內動脈,避開翼額動脈,線栓頭端距頸動脈分叉處9～10 mm 感覺有輕微阻力時停止。通過多普勒血流儀(Peri Flux System 5000,Perimed) 判斷血液流速,下降至70%～80%即為模型成功,缺血60 min 后將線栓輕輕抽出再灌注,縫合切口,待小鼠蘇醒后,放回飼養(yǎng)籠中,進行后續(xù)實驗。Sham 組操作同上,不插入線栓。

1.4 免疫熒光染色 小鼠麻醉致死,灌流固定,30 μm冰凍切片,PBS 洗5 min 3 次,5%BSA 室溫封閉1 h,PBS 洗,一抗4℃孵育過夜,PBS 洗5 min 3 次,二抗室溫孵育1 h,PBS 洗5 min 3 次,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核5 min,PBS 洗滌,封片鏡檢。

1.5 Western 印跡 小鼠麻醉致死,冷PBS 灌流,取半暗帶組織,提取組織總蛋白,BCA 法測蛋白濃度,變性。按各組蛋白濃度等質量上樣,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗4℃孵育過夜,PBST 洗5 min 3 次,二抗室溫孵育2 h,PBST 洗5 min 3 次,加發(fā)光液,暗室曝光,掃描儀對膠片進行掃描,獲取清晰條帶圖片,Image J 進行灰度分析。

1.6 腦梗死體積測定 小鼠麻醉致死,冷PBS 灌流,取腦,-20℃冷凍10 min,取出后放置小鼠腦槽中,1 mm 厚度連續(xù)6 片冠狀切片,2%TTC 37℃孵育30 min,4%多聚甲醛(PFA)終止反應并固定,拍照。Image J 計算梗死區(qū)占對側半球體積百分比。

1.7 qPCR 小鼠麻醉致死,冷PBS 灌流,取半暗帶組織,液氮速凍,按動物組織總RNA 提取試劑盒操作步驟,提取組織總RNA,1.2%核酸膠檢測RNA 完整性,并對RNA 濃度進行測定。按cDNA 第一鏈合成試劑盒操作步驟,反轉錄cDNA,上機進行qPCR 檢測。

1.8 神經功能缺陷評分 參考Li 等〔19〕的14 分制,分別對再灌注后0、1、3、5、7、14、21 d 進行神經功能缺陷評分。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism6 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1 缺血再灌注后不同劑量紅景天苷對神經功能恢復的影響 2.5,5.0,10.0,20.0 mg/kg 的紅景天苷與溶劑相比,對腦卒中后3 d 的神經功能恢復都有顯著促進作用〔(8.856 ±0.325) 分、(7.700 ±0.227)分、(7.471±0.288)分、(6.043±0.201)分、(7.400 ± 0.324) 分;P＜0.05,P＜0.001〕, 但10.0 mg/kg的效果最好,表明10 mg/kg 為紅景天苷的最佳劑量,這一劑量被用于之后的實驗。

2.2 缺血再灌注后紅景天苷減小了梗死體積,降低了神經功能缺陷評分 缺血再灌注3 d,與Sham 組相比,MCAO+Vehicle 組、MCAO+Sal 組均出現(xiàn)了明顯梗死,神經功能缺陷明顯。與MCAO+Vehicle 組〔(43.92±1.06)%〕相比,MCAO+Sal 組梗死體積〔(39.31±0.93)%〕顯著減小(P＜0.01)。再灌注1、3、5、7、14、21 d 神經功能缺陷評分顯著降低(P＜0.05)。見表1、圖1。

表1 兩組不同時間神經功能缺陷評分比較(±s,n=6,分)

表1 兩組不同時間神經功能缺陷評分比較(±s,n=6,分)

與MCAO+Vehicle 組比較:1)P＜0.05

1 d3 d5 d7 d14 d21 d MCAO+Vehicle 組11.16±0.3110.17±0.329.84±0.358.31±0.218組別.00±0.376.50±0.43 MCAO+Sal 組8.83±0.311)8.50±0.221)7.83±0.261)6.67±0.191)5.35±0.231)4.17±0.341)

圖1 缺血再灌注后紅景天苷對梗死體積與神經功能缺陷的影響

2.3 缺血再灌注后紅景天苷抑制了缺血半暗帶神經元的丟失 缺血再灌注3 d,與Sham組相比,MCAO+Vehicle 組、MCAO+Sal 組缺血半暗帶NeuN陽性細胞數(shù)顯著減少(P＜0.001);與MCAO + Vehicle 組相比,MCAO + Sal 組缺血半暗帶NeuN 陽性細胞數(shù)顯著增多(P＜0.001),紅景天苷抑制了缺血半暗帶神經元的丟失。見表2、圖2。

表2 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶NeuN、TUNEL 陽性細胞數(shù)的影響(±s,n=4,個)

表2 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶NeuN、TUNEL 陽性細胞數(shù)的影響(±s,n=4,個)

與Sham 組比較:1)P＜0.001;與MCAO+Vehicle 組相比較:2)P＜0.001

組別NeuNTUNEL Sham 組2 768.13±80.991.1825±0.39 MCAO+Vehicle 組299.61±19.141)507.09±9.971)MCAO+Sal 組691.79±42.811)2)314.67±9.871)2)

圖2 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶NeuN 陽性細胞數(shù)的影響(NeuN 染色,×200)

2.4 缺血再灌注后紅景天苷抑制缺血半暗帶腦細胞凋亡 缺血再灌注3 d,Sham 組未見TUNEL 陽性細胞的表達,MCAO+Vehicle 組、MCAO+Sal 缺血半暗帶均能明顯觀察到TUNEL 陽性細胞表達。與MCAO+Vehicle 組相比,MCAO+Sal 組缺血半暗帶TUNEL 陽性細胞的表達數(shù)量明顯減少(P＜0.001)。見表2、圖3。

圖3 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶TUNEL 陽性細胞數(shù)的影響(TUNEL 染色,×200)

2.5 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶凋亡相關蛋白及mRNA 表達量的影響 缺血再灌注3 d,與Sham 組相比,MCAO+Vehicle 組、MCAO + Sal 組Bax、Cytochrome C、Caspase-3 蛋白及mRNA 表達量顯著上升(P＜0.05),Bcl-2 蛋白及mRNA 顯著性下降(P＜0.05)。與MCAO+Vehicle 組相比,MCAO+Sal 組的Bax、Cytochrome C、Caspase-3 蛋白及mRNA表達顯著性下降,Bcl-2 蛋白及mRNA 顯著上升(P＜0.05)。見表3、圖4。

表3 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶凋亡相關蛋白及mRNA 表達量的影響(±s)

表3 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶凋亡相關蛋白及mRNA 表達量的影響(±s)

與Sham 組比較:1)P＜0.05;與MCAO+Vehicle 組比較:2)P＜0.05

組別Bcl-2蛋白(n=6) mRNA(n=4)Bax蛋白(n=6) mRNA(n=4)Cytochrome C蛋白(n=6) mRNA(n=4)Caspase-3蛋白(n=6) mRNA(n=4)7±0.031.00±0.210.14±0.021.00±0.30 MCAO+Vehicle 組 0.22±0.031) 0.31±0.241) 0.73±0.021) 1.96±0.311) 0.90±0.021) 3.37±0.361) 0.66±0.031) 2.37±0.401)MCAO+Sal 組0.37±0.021)2) 0.55±0.211)2) 0.39±0.021)2) 1.45±0.271)2) 0.51±0.031)2) 1.98±0.351)2) 0.53±0.021)2) 1.65±0.411)2)Sham 組0.77±0.031.00±0.230.27±0.011.00±0.250.2

圖4 缺血再灌注后紅景天苷對缺血半暗帶凋亡相關蛋白表達量的影響

3 討 論

紅景天苷屬于景天科植物紅景天的一種有效的生物活性成分,是我國十分珍貴的傳統(tǒng)中藥之一,具有抗疲勞、抗衰老、免疫調節(jié)、清除氧自由基等多種藥理作用。有文獻報道紅景天苷對心肌缺血具有保護作用,抑制心肌細胞的凋亡〔19～21〕。但腦缺血再灌注后紅景天苷對腦組織的保護機制鮮有報道。本研究結果表明,紅景天苷減小了缺血再灌注后缺血側的梗死體積,同時降低了神經功能缺陷評分,證明了紅景天苷對腦缺血再灌注具有保護作用。神經保護是治療缺血性腦卒中的重要途徑之一,本研究結果表明,缺血再灌注后紅景天苷抑制了缺血半暗帶神經元的丟失及腦細胞的凋亡。細胞凋亡是缺血再灌注后細胞的死亡方式之一,受多種基因與蛋白的調控〔22〕。Bcl-2 家族是目前研究較多的與細胞凋亡相關的基因家族,該家族中抗凋亡因子Bcl-2 和促凋亡因子Bax 在細胞凋亡過程起著促進與抑制的作用〔23〕。Cytochrome C 在凋亡中起著非常重要的作用,常被看作是凋亡的起始標志。此蛋白位于線粒體外膜和內膜間的空隙中,凋亡誘導物能引發(fā)Cytochrome C 從線粒體釋放到細胞質中,并在此與凋亡酶激活因子(Apaf)-1 結合,Cytochrome C/Apaf-1 復合物激活Caspase-9,進而激活Caspase-3〔24〕。Caspases 是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶,凋亡的最后實施是通過Caspases 的激活而實現(xiàn)的,Caspase-3 是Caspases級聯(lián)反應中下行的最關鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶,其表達量的高低預示著凋亡程度的高低〔25,26〕。本研究結果表明,腦缺血再灌注后,紅景天苷對腦細胞凋亡的抑制作用的其中一條途徑是通過上調抗凋亡因子Bcl-2或下調促凋亡因子Bax 的表達,抑制Cytochrome C 從線粒體向細胞質的釋放,進而下調Caspase-3 的表達,即通過抑制細胞凋亡的內源性途徑而發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷的保護作用。