彭定 周登峰 匡琪 (武漢市第四醫(yī)院 康復科,湖北 武漢 430034; 呼吸與危重癥醫(yī)學)

一項全球性調查統(tǒng)計研究顯示,每年肺癌患者約200 萬例,發(fā)病率、死亡率均較高〔1〕。由結核分枝桿菌(MTB)引起的肺結核是肺癌患者最常見的并發(fā)疾病,而MTB 感染是肺癌患者手術禁忌證〔2〕,分析肺癌對MTB 感染的影響具有重要臨床意義。微小RNA(miRNA)是一種單鏈RNA,長度約為22 個核苷酸,其在轉錄后的基因調控中發(fā)揮重要作用〔3〕。研究顯示miR-20a 會抑制巨噬細胞對MTB的吞噬作用,然而在肺癌中,miR-20a 是否參與MTB感染仍不清楚〔4〕。含核苷酸結合寡聚化結構域的蛋白質(NOD)2 蛋白可在免疫細胞核上皮細胞中表達,可通過識別MTB 促進炎性反應激活機體的免疫反應〔5〕。而NOD2 表達受miRNA 的靶向調控〔6〕。本文擬分析miR-20a 靶向NOD2 在肺結核合并肺癌患者MTB 感染中的作用。

1 材料與方法

1.1 外周血樣本 回顧性收集武漢市第四醫(yī)院133 例老年肺癌合并MTB 患者樣本。其中男72 例,女61 例,年齡61～77 歲,平均(68.85±3.24)歲?；仡櫺允占?24 例老年單純肺癌不合并MTB 感染患者為肺癌組,其中男69 例,女55 例,年齡62～79 歲,平均(69.31±3.46)歲。選擇80 例健康體檢者為健康組,男41 例,女39 例,年齡60～70 歲,平均(69.04 ±3.78) 歲。納入標準:(1)年齡60～80 歲;(2)確診為肺癌或MTB 感染;(3)知情同意。排除標準:(1)組織收集前3 個月內接受過肺癌或抗結核的相關治療;(2)合并血液學疾病、感染或其他炎癥;(3)合并其他癌癥。檢查患者血清樣本和腫瘤組織樣本。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 材料 人肺癌細胞A549(美國ATCC 公司),96 及24 孔組織培養(yǎng)板(美國康寧公司)。RPMI 1640 培養(yǎng)基核抗體(美國Gibco 公司)。miR-20a 類似物(mimic)及NOD2 過表達質粒、相應陰性對照(NC,中國吉瑪公司)。Lipofectamine ?2000(美國Invitrogen 公司)。中國Aidlab 公司Trizol 試劑。中國Beyotime 公司快速定點誘變試劑盒及Renilla 熒光素酶質粒。檢測儀1000 System 及熒光素酶試劑盒由美國Promega 公司提供。德國DBI Bioscience公司的BestarTMqPCR 試劑盒。美國GE Healthcare的RNAspin Mini 及miRNeasy Mini 試劑盒。美國ABI 公司ABI7900 PCR 儀。美國Thermo Fisher 公司TaqMan miRNA 試劑盒。中國碧云天公司酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒。

1.3 雙熒光素酶報告檢測NOD2、miR-20a 靶向關系 Starbase 得到miR-20a 及NOD2 的堿基結合位點。將野生型(wt-)NOD2 序列擴增至pGL4 熒光素酶載體,突變型(mut-)NOD2 通過誘變試劑盒得到。1×104個A549 細胞接種在24 孔板中并通過Lipofectamine?2000 將1 μg wt-/mut-NOD2 熒光素酶質粒、50 nmol/L miR-20a mimic 或miR-20a NC 質粒轉染進入細胞,37℃下孵育,以Renilla 的活性檢測各組細胞中相對熒光素酶活性。

1.4 RT-qPCR 患者血清中miRNA 采取miRNeasy Mini 試劑盒進行提取,cDNA 由TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒形成,條件為:37℃、15 min,98℃、5 min。qPCR 實驗試劑盒為TaqMan miRNA,條件為:95℃、2 min,58℃、20 s、94℃、20 s、72 ℃、20 s,進行40 個循環(huán),72 ℃下延伸4 min。通過比較循環(huán)閾值并以U6 作為內參計算miR-20a 相對表達水平?；颊呒毎械目俁NA 使用RNeasy Mini 試劑盒提取,將其逆轉轉錄成cDNA,應用BestarTMqPCR 預混液實施qPCR 實驗,條件與上述相同。對比循環(huán)閾值,GAPDH 作為內參計算NOD2 mRNA 的表達水平。

1.5 ELISA 依次在患者血清中加入抗體與顯色劑,酶標儀測定450 nm 處吸光度,干擾素(IFN)-γ及白細胞介素(IL)-6 、腫瘤壞死因子(TNF)-α 濃度根據標準曲線進行計算。

1.6 Western 印跡 將腫瘤組織進行研磨及裂解,離心處理,收集總蛋白,4℃,12 000 r/min 離心5 min。并通過8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離樣品中等量(50 μg)蛋白質,轉移至硝酸纖維素膜上。室溫下,膜浸入5%脫脂牛奶,時間2 h,封閉非特異性抗原。4℃下,膜及NOD2 一抗孵育過夜,室溫下,將膜和相應的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗孵育1 h。采取化學發(fā)光試劑,應用Quantum One 軟件處理灰度計算蛋白相對于GAPDH 表達量,計算NOD2 相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學方法 采取SPSS22.0 軟件進行t檢驗、Pearson 相關性分析。

2 結 果

2.1 雙熒光素酶報告驗證miR-20a 與NOD2 的靶向關系 圖1 為miR-20a 與NOD2 靶向結合位點。轉染共同轉染wt-NOD2 及miR-20a mimic,樹突細胞中相對熒光素酶活性明顯降低(P＜0.05),證實miR-20a 與NOD2 的靶向結合。見表1。

表1 雙熒光素酶報告驗證miR-20a 與NOD2 的靶向關系(相對熒光素酶活性,±s,n=5)

表1 雙熒光素酶報告驗證miR-20a 與NOD2 的靶向關系(相對熒光素酶活性,±s,n=5)

與miR-20a NC 組比較:1)P＜0.05

組別wt-NOD2mut-NOD2 miR-20a NC 組1.00±0.091.01±0.11 miR-20a mimic 組0.31±0.031)0.97±0.10

圖1 miR-20a 與NOD2 mRNA 的3′端的非翻譯區(qū)域的結合位點

2.2 各組IFN-γ、IL-6 和TNF-α 水平比較 肺癌組血清IFN-γ、IL-6 和TNF-α 水平顯著高于健康組,肺癌+MTB 組顯著高于肺癌組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組IFN-γ、IL-6 和TNF-α 水平比較(±s,pg/ml)

表2 各組IFN-γ、IL-6 和TNF-α 水平比較(±s,pg/ml)

與健康組比較:1)P＜0.05;與肺癌組比較:2)P＜0.05;下表同

組別nIL-6TNF-αIFN-γ 13331.07±4.2648.57±6.1619.84±2.95肺癌組124 43.71±5.741) 62.49±7.951) 25.78±3.141)肺癌+MTB 組 80 65.82±7.311)2) 80.23±8.261)2) 37.56±4.561)2)健康組

2.3 感染MTB 的肺癌組織中miR-20a 和NOD2 mRNA 及蛋白表達水平和相關性 3 組肺癌組織中miR-20a、NOD2 mRNA 和蛋白表達水平差異顯著(P＜0.05)。肺癌組腫瘤組織中miR-20a 顯著高于健康組,而NOD2 mRNA 和蛋白表達水平顯著低于健康組(P＜0.05)。肺癌+MTB 組miR-20a 顯著高于肺癌組,NOD2 mRNA 及蛋白表達水平顯著低于肺癌組(P＜0.05)。見圖2、表3。感染MTB 的肺癌組織中miR-20a 與NOD2 mRNA 及蛋白水平均呈顯著負相關(r= -0.541,P=0.006;r= -0.506,P=0.004)。

圖2 Western 印跡檢測各組miR-20a 和NOD2 表達

表3 各組miR-20a 和NOD2 表達比較(±s)

表3 各組miR-20a 和NOD2 表達比較(±s)

組別nmiR-20aNOD2 mRNANOD2蛋白健康組1331.00±0.141.00±0.111.00±0.11肺癌組1242.89±0.271)0.74±0.091)0.69±0.091)肺癌+MTB 組 80 4.32±0.411)2) 0.39±0.061)2) 0.40±0.061)2)

3 討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率均位于所有癌癥的首位,其5年生存率約為15%〔7〕。肺結核不但是誘發(fā)肺癌的發(fā)病因素之一,還會引起肺部炎癥,加劇肺癌患者的免疫抑制,從而提高肺癌患者的死亡風險〔8〕,但關于肺癌患對MTB 感染的影響仍不清楚。

miRNA 可通過堿基配對識別并結合mRNA,進而誘導mRNA 的降解或抑制翻譯〔9〕。miR-20a 是一種新發(fā)現(xiàn)的肺癌相關miRNA,miR-20a 在肺癌患者中過表達,并且促進肺癌細胞的增殖和轉移〔10,11〕。miR-20a 的過表達促進分枝桿菌存活,miR-20a 下調觸發(fā)巨噬細胞相關凋亡,從而促進宿主防御MTB 感染〔12〕。而miR-20a 的升高則會抑制組織免疫能力,促進MTB 感染〔13〕。Tang 等〔14〕研究結果表明miR-20a 的升高參與腫瘤患者的免疫抑制效應,抑制患者自身免疫能力。結合文獻報道和本研究結果提示肺癌患者中miR-20a 的水平升高,而miR-20a 的升高能通過抑制患者的免疫能力促進MTB 的感染。

NOD2 是細胞質中細菌肽聚糖保守基序的傳感器,可刺激隨后的先天免疫反應〔15〕。NOD2 蛋白可通過IKK-gamma 誘導NF-kappa-B,從而促進機體對細胞內包括MTB 在內的病原體的響應〔16〕。此外,NOD2 也參與肺癌的發(fā)生和進展,研究顯示肺癌組織中NOD2 的水平降低,而這會引起肺癌微環(huán)境的免疫抑制效應,從而促進肺癌進展〔17〕。有研究發(fā)現(xiàn)在炎癥性腸病中,miR-20a 升高會通過靶向抑制NOD2 蛋白的水平參與炎性反應〔18〕。本研究結果提示肺癌組織中miR-20a 可能通過靶向抑制NOD2 蛋白表達,這不但促進了肺癌進展,還可能通過引起免疫抑制促進MTB 的感染。然而,關于miR-20a 靶向NOD2 調控MTB 感染的機制仍需要進一步的細胞實驗和動物實驗驗證,而關于MTB 感染是否會通過miR-20a/NOD2 引起肺癌的發(fā)生也值得進一步研究。