才金玲，劉 潔，王 雨，張鑫志，邱 琦，關 月

(1 天津科技大學 化學工程與材料科學學院，天津市鹵水化學工程與資源生態(tài)利用重點實驗室，天津 300457；2.天津長蘆漢沽鹽場有限責任公司，天津 300480)

杜氏鹽藻是咸水、沼澤和濕地等環(huán)境中普遍存在的浮游植物[1]，由于其特殊生理構(gòu)造及特性，杜氏鹽藻有很寬的環(huán)境適宜范圍，其可以在從0.5%到約35%的飽和濃度的化學品和鹽成分中生活，對溫度和pH值的適宜范圍比較理想。 在人工控制和脅迫條件下，杜氏鹽藻大量積累β-胡蘿卜素，大約占到干重的10%～14%。杜氏鹽藻已成為用于β-胡蘿卜素生物生產(chǎn)的最佳微藻物種之一[2]。近年來，杜氏鹽藻的β-胡蘿卜素生產(chǎn)能力約為1 200 t/a[3]，預計將滿足95%以上的β-胡蘿卜素總需求[4]。除此之外，杜氏鹽藻在飼料生產(chǎn)[5]、工業(yè)[6]及醫(yī)藥[7]應用方面均有著不錯的應用潛力。

長期以來，用于商業(yè)目的的微藻培養(yǎng)及生產(chǎn)最常見的生產(chǎn)方式是使用室外開放池培養(yǎng)?，F(xiàn)有培養(yǎng)基配方中，以海水為溶劑的配方最具發(fā)展?jié)摿?，尤其對靠近海岸取海水方便的鹽藻產(chǎn)業(yè)基地極具成本優(yōu)勢，因此針對各地區(qū)海水主要成分改良對應的養(yǎng)殖配方可以最大化降低污染風險和降低培養(yǎng)成本。

研究以杜氏鹽藻為實驗對象，以渤海灣海水為培養(yǎng)溶劑，針對碳源、氮源、磷源、鹽度、鈣離子和鎂離子的種類及含量對該藻種生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響進行實驗，并對這六項進行整合，目的是優(yōu)化出一項更適合鹽藻養(yǎng)殖的海水配置的培養(yǎng)基。對鹽藻的大規(guī)模生產(chǎn)提供科學的理論基礎和數(shù)據(jù)支撐，以實現(xiàn)促進國內(nèi)鹽藻產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

配置培養(yǎng)基所用海水取自天津市濱海新區(qū)長蘆漢沽鹽場有限責任公司，經(jīng)過濾后使用。

藻種。天津長蘆漢沽鹽場有限責任公司提供，經(jīng)純化后使用。

培養(yǎng)條件。取培養(yǎng)至對數(shù)期的藻液為種液，按10%接種量，接種于250 mL錐形瓶中，培養(yǎng)基100 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件設置為：溫度25 ℃，光照強度6 000 lx，光暗比為12 h ∶12 h，每天定時搖瓶3次。

初始培養(yǎng)基。NaNO3425 mg/L，NaH2PO4·2H2O 15.6 mg/L，KCl 74 mg/L，NaHCO3840 mg/L，檸檬酸鐵13 mg/L，MgSO4·7H2O 1.23 g/L，CaCl233 mg/L，A5溶液1 mL/L，使用NaCl調(diào)整鹽度至8.5%。實驗所用培養(yǎng)基均用海水進行配置。

1.2 實驗方法

1.2.1 海水成分測定

參考國家標準GB/T33584.1-2017，取適量海水，分別使用鈣—羧酸和鉻黑T為指示劑，用EDTA標準溶液測定海水中的Ca2+和Mg2+含量，使用電感耦合等離子質(zhì)譜儀測P含量，使用全自動凱氏定氮儀來測定中N含量。

分別使用pH計、鹽度計和密度計來測定海水的pH值、鹽度和密度。

1.2.2 單因素實驗設計

(1)碳源單因素實驗。選用未加碳源的初始培養(yǎng)基，以葡萄糖、碳酸氫鈉和乙酸鈉為三組碳源，設置0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L三組濃度，以不加碳源為對照。

(2)氮源單因素實驗。選用未加氮源的初始培養(yǎng)基，以硝酸鈉、氯化銨和尿素為三組氮源，設置5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L三組濃度，以不加氮源為對照。

(3)磷濃度單因素實驗。選用未加磷源的初始培養(yǎng)基，以磷酸二氫鈉為單一磷源，設置0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L五組濃度，以不加磷源為對照。

(4)鹽度單因素實驗。對初始培養(yǎng)基中添加的氯化鈉形成的培養(yǎng)基鹽度設置四組鹽度對比：鹽度7%、鹽度8%、鹽度9%、鹽度10%，以不加任何氯化鈉的純海水培養(yǎng)基為對照。

(5)鈣離子單因素實驗。選用未加任何鈣離子的初始培養(yǎng)基，以無水氯化鈣為單一鈣源，設置0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L五組濃度，以不加任何鈣離子為對照。

(6)鎂離子單因素實驗。選用未加任何鎂離子的初始培養(yǎng)基，以七水硫酸鎂為單一鎂源，設置1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L、7 mmol/L、9 mmol/L五組濃度，以不加任何鎂離子為對照。

1.2.3 細胞計數(shù)

取1 mL藻液，滴于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下進行細胞計數(shù)，對每個樣品計數(shù)三次，取其平均值。

1.2.4 β-胡蘿卜素及葉綠素a、b的測定

取3 mL生長至對數(shù)期的鹽藻藻液，6 000 r/min離心20 min后去掉上清液，加入3 mL 90%的丙酮溶液，震蕩破碎后避光保存24 h提取色素，并于分光光度計上讀取D450nm、D665nm、D649nm。

根據(jù)式(1)換算出藻液中β-胡蘿卜素的含量：

(1)

式中：β——β-胡蘿卜素的含量，mg/L；V——提取液的體積，mL;f——稀釋倍數(shù);2 500——吸光度與β-胡蘿卜素的換算系數(shù)。

根據(jù)式(2)和式(3)計算葉綠素a、b的含量：

葉綠素a含量(mg/L)=13.7D665nm-5.76D649nm

(2)

葉綠素b含量(mg/L)=25.8D649nm-7.6D665nm

(3)

1.2.5 總糖及蛋白質(zhì)含量

采用苯酚硫酸法檢測藻液中的總糖含量，采用考馬斯亮藍法測定藻液中蛋白質(zhì)的含量。

1.3 顯著性數(shù)據(jù)分析

所有實驗在實驗時均設置3個平行實驗，所得數(shù)據(jù)使用SPSS中的LSD進行單因素ANOVA方差顯著性分析進行分析。以P<0.05為差異顯著性的標準，實驗結(jié)果表示為平均值±標準偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗所用海水成分(表1)

表1 實驗所用海水成分

表1是通過標準溶液標定法、電感耦合等離子發(fā)射光譜法(ICP)、pH計、密度計和鹽度計測得的海水中Mg、Ca、P等其他元素的含量以及pH值、鹽度和密度的數(shù)值。通過表1中數(shù)據(jù)可以看出實驗所測得海水中鈣含量為(417.4±20.6) mg/L，鎂含量為(1 487.1±36.1) mg/L，鈣鎂離子含量略高于海南地區(qū)及其他地區(qū)海水中鈣鎂離子含量[8-10]，考慮到不同海域中鈣鎂離子不盡相同，因此該數(shù)據(jù)雖存在微小差異但在合理范圍內(nèi)；磷含量測得38.28 μg/L，與他人實驗數(shù)據(jù)相同[11]；氮含量測得2 mg/L，略高于許振飛所測得1.27 mg/L～1.71 mg/L[12]，說明海水中含有大量氮，有利于鹽藻培養(yǎng)；實驗測得pH值與鹽度與他人實驗數(shù)據(jù)相似[13-14]；測得取樣海水密度(ρs,t,p)為1.02 g/cm3，與蘇校平等測得的條件密度(σs,t,p)19 kg/m3～23 kg/m3相似[15]。

2.2 杜氏鹽藻光譜掃描結(jié)果及最佳測定波長的確定

生長至穩(wěn)定期的杜氏鹽藻的光譜掃描結(jié)果見圖1。

圖1 杜氏鹽藻光譜掃描

通過圖1可看出，杜氏鹽藻在波長680 nm處出現(xiàn)最大光吸收峰，這表明杜氏鹽藻的最佳測定波長為680 nm。因此在后續(xù)培養(yǎng)實驗和絮凝實驗中，均選擇680 nm為杜氏鹽藻最佳測定波長。

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化的結(jié)果

2.3.1 不同碳源種類及濃度對鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響

實驗測試了三種不同的碳源(碳酸氫鈉、葡萄糖和乙酸鈉)對杜氏鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響，以不加任何碳源為空白組對照。

圖2 不同碳源種類及濃度對鹽藻生長的影響

圖3 不同碳源種類及濃度對色素積累的影響

圖4 不同碳源種類及濃度對蛋白質(zhì)積累的影響

圖5 不同碳源種類及濃度對總糖積累的影響

乙酸鈉對鹽藻生長積累雖有促進作用，但不及碳酸氫鈉，其中蛋白質(zhì)積累最高可達17.61 mg/mL±0.77 mg/mL，總糖積累最高可達2.88%±0.20%，但在鹽藻的細胞量和色素積累上卻起到了抑制作用。同時葡萄糖對鹽藻的生長發(fā)育也產(chǎn)生了抑制作用，葡萄糖擔當唯一碳源時，三種濃度下細胞量、蛋白質(zhì)和色素的積累量均為測試期間的最低值。推測原因可能是因為葡萄糖在培養(yǎng)期間受氧化生成了葡萄糖酸、葡萄糖二酸或者葡萄糖醛酸等酸性物質(zhì)，這些物質(zhì)的積累導致了培養(yǎng)基pH值降低呈酸性，抑制了鹽藻的生長發(fā)育。

因此碳酸氫鈉可以選擇作為促進杜氏鹽生長及生物質(zhì)資源積累的最適宜碳源。

2.3.2 不同氮源種類及濃度對鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響

實驗測試了三種不同的氮源(硝酸鈉、氯化銨和尿素)對杜氏鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響，以不加任何氮源為空白組對照。

結(jié)果見圖6～圖9，硝酸鈉對杜氏鹽藻的生長和營養(yǎng)物質(zhì)的積累均起到了積極作用，相對比不加氮源的情況下生物量產(chǎn)量顯著增加。其中5 mmol/L濃度下的硝酸鈉培養(yǎng)基中細胞密度為(2.29±0.25)×106cells/mL，較10 mmol/L和15 mmol/L濃度下碳酸氫鈉培養(yǎng)基細胞密度高；5 mmol/L濃度下的硝酸鈉培養(yǎng)基中色素含量(葉綠素a、葉綠素b和β-胡蘿卜素)分別為4.66 μg/mL±0.42 μg/mL、2.39 μg/mL±0.02 μg/mL和1.78 μg/mL±0.12 μg/mL，較10 mmol/L和15 mmol/L濃度下的硝酸鈉培養(yǎng)基中積累的色素含量高；5 mmol/L濃度下硝酸鈉培養(yǎng)基中總糖為1.51%±0.03%，較10 mmol/L和15 mmol/L濃度下的硝酸鈉培養(yǎng)基總糖含量高。三種氮源培養(yǎng)基中，共同現(xiàn)象每毫升藻液中蛋白質(zhì)含量與培養(yǎng)基中氮濃度成正比，此現(xiàn)象與宋雨晴等[18]的研究發(fā)現(xiàn)相一致，說明高濃度氮有利于鹽藻細胞積累蛋白質(zhì)。

圖6 不同氮源種類及濃度對鹽藻生長的影響

圖7 不同氮源種類及濃度對鹽藻色素積累的影響

圖8 不同氮源種類及濃度對鹽藻蛋白質(zhì)積累的影響

圖9 不同氮源種類及濃度對鹽藻總糖積累的影響

綜合實驗數(shù)據(jù)分析可知，鹽藻在以氯化銨或尿素為氮源時生長發(fā)育及生物質(zhì)資源積累情況均顯著低于以硝酸鈉為氮源時的生長情況。因此鹽藻對尿素和氯化銨這些有機氮源很難有效利用，也證實了尿素的存在確實一定的毒性。因此硝酸鈉較之銨態(tài)氮更適合作為鹽藻培養(yǎng)的氮源。

2.3.3 不同磷濃度對鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響(圖10～圖13)

圖10 不同磷濃度對鹽藻生長的影響

圖11 不同磷濃度對鹽藻色素積累的影響

由圖10～圖13可知，鹽藻在磷濃度0 mmol/L～25 mmol/L范圍內(nèi)均可正常生長，且在此范圍內(nèi)鹽藻生長和營養(yǎng)物質(zhì)積累情況與培養(yǎng)環(huán)境中磷濃度成正比。其中20 mmol/L濃度下的磷酸二氫鈉培養(yǎng)基中細胞密度為(3.38±0.25)×106cells/mL，較其他濃度下磷酸二氫鈉培養(yǎng)基細胞密度高，生長情況與郁彬琦等[19]所測得鹽藻生物量相似；20 mmol/L濃度下磷酸二氫鈉培養(yǎng)基中色素含量(葉綠素a、葉綠素b和β-胡蘿卜素)分別為15.50 μg/mL±0.10 μg/mL、6.50 μg/mL±0.08 μg/mL和4.91 μg/mL±0.07 μg/mL，較5 mmol/L和15 mmol/L濃度下磷酸二氫鈉培養(yǎng)基中積累的色素含量高；20 mmol/L濃度下磷酸二氫鈉培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)積累含量為3.72 mg/mL±0.02 mg/mL，較其他濃度下磷酸二氫鈉培養(yǎng)基中積累的蛋白質(zhì)含量高；20 mmol/L濃度下磷酸二氫鈉培養(yǎng)基中總糖為1.06%±0. 07%，較其他濃度下磷酸二氫鈉培養(yǎng)基總糖含量高。

圖12 不同磷濃度對鹽藻蛋白質(zhì)積累的影響

圖13 不同磷濃度對鹽藻總糖積累的影響

綜上所述，20 mmol/L濃度的磷酸二氫鈉為杜氏鹽藻的最適宜生長磷濃度，其生物量產(chǎn)率，蛋白質(zhì)、色素和總糖積累量均為最高。

2.3.4 不同鹽度對鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響(圖14～圖17)

圖14 不同鹽度對鹽藻生長的影響

圖15 不同鹽度對鹽藻色素積累的影響

圖16 不同鹽度對鹽藻蛋白質(zhì)積累的影響

圖17 不同鹽度對鹽藻總糖積累的影響

實驗測試了7%～10%四種不同的鹽度對杜氏鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響，以不加任何氯化鈉的純海水為空白組對照。

鹽藻在5%到10%的鹽度范圍內(nèi)均可正常生長，從圖中可以看出，當鹽度為7%和8%時，鹽藻細胞密度明顯高于空白組，且優(yōu)勢一直保持到穩(wěn)定期，最高達到了(3.94±0.11)×106cells/mL，較其他鹽度下的培養(yǎng)基中細胞密度高，說明在鹽度為7%和8%時鹽藻可大量且快速生長。同時鹽度10%培養(yǎng)基色素積累情況和細胞密度在生長期和穩(wěn)定期均低于未額外加鹽的空白對照組，說明雖然鹽藻對鹽度適應范圍很廣，但較高的鹽度仍然會抑制鹽藻的生長和生物質(zhì)積累，此現(xiàn)象與張曉釵等[20]發(fā)現(xiàn)的高鹽環(huán)境對藻細胞的脅迫作用相一致。推測原因為鹽藻為適應高鹽環(huán)境會縮小體積且減少運動，從而減少了從環(huán)境中汲取及積累營養(yǎng)物質(zhì)的過程。

綜上所述，7%～8%的環(huán)境鹽度為最適合鹽藻培養(yǎng)的鹽度，此鹽度下杜氏鹽藻的細胞密度、色素積累、總糖和蛋白質(zhì)積累含量可以達到峰值。

2.3.5 不同鈣離子濃度對鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響

實驗測試了額外添加0.1 mmol/L～0.5 mmol/L鈣離子五種不同的鈣離子添加量對杜氏鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響，以不額外添加任何鈣離子的純海水為空白組對照。

結(jié)果見圖18～圖21，額外添加鈣離子量的多少對鹽藻生長沒有顯著的促進作用，相反在不額外添加任何鈣離子情況下，鹽藻細胞密度最高可達(2.31±0.10)×106cells/mL，高于額外添加了鈣離子的五組實驗組，且色素、蛋白質(zhì)和總糖含量積累也無顯著性差異?？紤]到受測海水中鈣離子含量達到了(417.4±20.6) mg/L，額外添加鈣離子可能會因為濃度的增加而產(chǎn)生氧化應激，從而擾亂藻類細胞的穩(wěn)態(tài)[21]。

圖18 不同鈣離子濃度對鹽藻生長的影響

圖19 不同鈣離子濃度對鹽藻色素積累的影響

圖20 不同鈣離子濃度對鹽藻蛋白質(zhì)積累的影響

圖21 不同鈣離子濃度對鹽藻總糖積累的影響

2.3.6 不同鎂離子種類及濃度對鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響

實驗測試了額外添加1 mmol/L～9 mmol/L鎂離子五種不同的鎂離子添加量對杜氏鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響，以不額外添加任何鎂離子的純海水為空白組對照。

結(jié)果見圖22～圖25，額外添加鎂離子量的多少對鹽藻生長同樣沒有顯著促進作用，在培養(yǎng)基中額外添加鎂離子的情況下，鹽藻的細胞密度最高可達(3.21±0. 05)×106cells/mL，此數(shù)值接近于不額外添加鎂離子的空白處理組的(3.21±0. 09)×106cells/mL，且色素、蛋白質(zhì)和總糖含量積累也無顯著性差異。考慮到受測海水中鎂離子含量達到了1 487.1 mg/L±36.1 mg/L，接近于劉建坤[22]所測得最適合杜氏鹽藻生長是鎂離子濃度7 mmol/L，因此額外添加鎂離子可能會抑制鹽藻生長。

圖22 不同鎂離子濃度對鹽藻生長的影響

圖23 不同鎂離子濃度對鹽藻色素積累的影響

圖24 不同鎂離子濃度對鹽藻蛋白質(zhì)積累的影響

圖25 不同鎂離子濃度對鹽藻總糖積累的影響

2.3.7 培養(yǎng)條件優(yōu)化前后培養(yǎng)效果對比

總結(jié)2.3.1～2.3.6六項實驗結(jié)果，選取最適合杜氏鹽藻的最佳單因素并對原培養(yǎng)基進行優(yōu)化，可得優(yōu)化后的新培養(yǎng)基，配方見表2。

表2 優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方

根據(jù)表2內(nèi)成分配制培養(yǎng)基，取培養(yǎng)至對數(shù)期的藻液為種液，按10%的接種量，接種于250 mL的錐形瓶中，培養(yǎng)基100 mL，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件設置為：溫度25 ℃，光照強度6 000 lx，光暗比為12h ∶12h，每天定時搖瓶3次。此為實驗組，設置以優(yōu)化前培養(yǎng)基培養(yǎng)的鹽藻為對照組。

結(jié)果見圖26～圖28。

圖26 培養(yǎng)基優(yōu)化前后對鹽藻生長的影響

圖27 培養(yǎng)基優(yōu)化前后對鹽藻色素積累的影響

圖28 培養(yǎng)基優(yōu)化前后對鹽藻蛋白質(zhì)和總糖積累的影響

實驗測試了改良后的培養(yǎng)基對杜氏鹽藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響，以原培養(yǎng)基為空白組對照。

優(yōu)化后的培養(yǎng)基對鹽藻生長有顯著的促進作用，鹽藻的細胞密度最高可達(4.00±0.17)×106cells/mL，色素含量(葉綠素a、葉綠素b和β-胡蘿卜素)分別達到了18.36 μg/mL±0.66 μg/mL、6.08 μg/mL±0.27 μg/mL和7.80 μg/mL±0.43 μg/mL；蛋白質(zhì)積累含量達到了2.74 mg/mL±0.16 mg/mL；總糖積累量為2.27%±0.08%，均顯著高于優(yōu)化前培養(yǎng)基的細胞密度及營養(yǎng)物質(zhì)積累量。

3 結(jié)論

文章以杜氏鹽藻為實驗藻株，對海水養(yǎng)殖杜氏鹽藻的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，并針對優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行了鹽藻的培養(yǎng)和營養(yǎng)成分測定，最終的實驗結(jié)果主要有以下幾點：

1)對杜氏鹽藻的培養(yǎng)進行單因素實驗，針對碳源、氮源、磷源、鹽度、鈣離子和鎂離子的種類及含量對該藻種生長及β-胡蘿卜素、蛋白質(zhì)和總糖等營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響，確定各個因素影響之下的最佳培養(yǎng)條件。根據(jù)最佳因素所改良的培養(yǎng)基配方為：NaNO3425 mg/L；NaH2PO4·2H2O 31.2 mg/L；KCl 74 mg/L；NaHCO3840 mg/L；檸檬酸鐵13 mg/L；MgSO4·7H2O 0 mg/L；CaCl20 mg/L；A5溶液1 mL/L，使用海水配置，并額外添加NaCl至鹽度7%～8%。

2)改良后的培養(yǎng)基對鹽藻生長有顯著促進作用，鹽藻細胞密度最高可達(4.00±0. 17)×106cells/mL，色素含量(葉綠素a、葉綠素b和β-胡蘿卜素)分別達到了18.36 μg/mL± 0.66 μg/mL、6.08 μg/mL±0.27 μg/mL和7.80 μg/mL±0.43 μg/mL；蛋白質(zhì)積累含量達到2.74 mg/mL±0.16 mg/mL；總糖積累量為2.27%±0.08%，均顯著高于原培養(yǎng)基的細胞密度及營養(yǎng)物質(zhì)積累量。