張 堯，張 鍇，馬 超

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科，鄭州 450008

胰腺癌是一類早期確診率低，死亡率高的惡性腫瘤，近年來，發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出不斷攀升之勢［1］。胰腺癌的高死亡率與其早期即發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移密不可分，近年來有研究證實(shí)，脂肪非典型鈣黏蛋白4（fat atypical cadherin 4，F(xiàn)AT4）基因可能作為抑癌基因，調(diào)控惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，但有關(guān)FAT4與胰腺癌關(guān)系的探索卻少見報(bào)道。

FAT4基因是果蠅ft基因的同源基因［2］，ft基因在果蠅整個(gè)發(fā)育過程中參與調(diào)控Hippo通路和平面細(xì)胞極性，是果蠅7個(gè)抑癌基因中的一個(gè)。近年來全基因組測序證實(shí)，F(xiàn)AT4基因在幾種類型惡性腫瘤中反復(fù)突變，最常見于黑色素瘤中，突變率達(dá)40%，F(xiàn)AT4信使核糖核酸（mRNA）在乳腺癌細(xì)胞系、肺腺癌［3］中表達(dá)明顯下調(diào)，下調(diào)與其啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。已有研究表明FAT4表達(dá)與乳腺癌［4］、肺癌、胃癌［5］等惡性腫瘤相關(guān)，通過直接抑制經(jīng)典Wnt/β－catenin通路或參與Hippo通路，發(fā)揮抑癌基因作用。

然而FAT4在胰腺癌中的表達(dá)及具體功能仍不清楚。本研究檢測FAT4蛋白在胰腺癌組織和正常組織中的表達(dá)，并分析FAT4蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集本院2015年1月—2017年1月期間79例行根治性手術(shù)切除，且術(shù)后病理確診為胰腺導(dǎo)管腺癌患者的胰腺癌組織及癌旁組織，其中胰頭癌60例，均行胰十二指腸切除術(shù)；胰體尾癌19例，均行胰體尾切除＋脾臟切除術(shù)。所有患者術(shù)前未接受放化療和免疫治療等其他治療。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯情況來自病理免疫組化診斷報(bào)告。依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer AJCC）第八版胰腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)［6］進(jìn)行腫瘤分期。

1.2 免疫組化 所有標(biāo)本手術(shù)后30 min內(nèi)放入10%福爾馬林溶液中進(jìn)行充分固定，常規(guī)修剪、脫水、石蠟包埋，采用EnVision法免疫組化染色，嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作?？乖迯?fù)、除內(nèi)源性過氧化物酶后，滴加FAT4抗體［兔抗人FAT4多克隆抗體（NEP1－78381），購自美國Novus Biological公司］稀釋至1∶150，4℃冰箱中過夜孵育，二抗孵育30 min后DAB顯色，復(fù)染、脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用已知陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 免疫組化評分 本研究中，胰腺癌組織或癌旁組織中，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕黃褐色顆粒狀、片狀染色則視為FAT4蛋白陽性表達(dá)。由兩名具有高級職稱的病理學(xué)醫(yī)師獨(dú)立盲法閱片后得出免疫組化結(jié)果，切片判讀使用200倍顯微鏡，每張切片觀察5個(gè)相鄰區(qū)域，每個(gè)視野至少包含100個(gè)細(xì)胞，每張切片重復(fù)評分3次，取平均值為最終結(jié)果，出現(xiàn)意見不一時(shí)則重新評估。

評分標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合染色強(qiáng)度和染色范圍兩方面綜合評定。染色強(qiáng)度：無染色為0分；黃色染色為1分；棕黃色染色為2分；棕褐色染色為3分。染色范圍：無染色或染色范圍＜10%為0分；10%≤染色范圍＜50%為1分；50%≤染色范圍＜75%為2分；染色范圍≥75%為3分。每張切片分別就染色強(qiáng)度和染色范圍評分，評分結(jié)果相加，0分為陰性“－”；1～2分為弱陽性“＋”；3～4分為中等陽性“＋＋”；5～6分為強(qiáng)陽性“＋＋＋”。其中，陰性（－）和弱陽性（＋）視為低表達(dá)，中等陽性（＋＋）和強(qiáng)陽性（＋＋＋）視為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 26.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。等級資料組間比較采用Mann－Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 79例患者中男48例，女31例，年齡在60歲以上23例，年齡在60歲以下56例；腫瘤最長徑≤4 cm者54例，腫瘤最長徑＞4 cm者25例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例；發(fā)生神經(jīng)侵犯41例，無神經(jīng)侵犯38例；組織學(xué)分級：高分化15例，中分化42例，低分化22例。TNM分期Ⅰ期24例、Ⅱ期49例、Ⅲ期6例、Ⅳ期0例。

2.2 FAT4蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 根據(jù)免疫組化染色結(jié)果，F(xiàn)AT4蛋白主要在胰腺癌細(xì)胞和癌旁組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，表現(xiàn)為黃色或黃褐色點(diǎn)片狀染色（圖1）。

圖1 FAT4蛋白在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況（免疫組化，×200）Figure 1 Expression of FAT4 protein in pancreatic cancer tissue and para－carcinoma tissue（immunohistochemistry，×200）

FAT4蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)分布不同，具有顯著差異（P＜0.001）。FAT4蛋白在胰腺癌組織中大多數(shù)呈陰性（－）、弱陽性（＋）表達(dá)，為低表達(dá)；FAT4蛋白在癌旁組織中大多數(shù)呈中等陽性（＋＋）、強(qiáng)陽性（＋＋＋）表達(dá)，為高表達(dá)（表1）。

表1 FAT4蛋白在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá)分布Table 1 Distribution of FAT4 expression in pancreatic cancer tissue and para－carcinoma tissue

胰腺癌組織中，F(xiàn)AT4蛋白低表達(dá)率72.15%（57/79），F(xiàn)AT4蛋白高表達(dá)率27.85%（22/79）；癌旁組織中，F(xiàn)AT4蛋白低表達(dá)率21.52%（17/79），F(xiàn)AT4蛋白高表達(dá)率78.48%（62/79）（表2）。總體而言，胰腺癌中FAT4呈低表達(dá)，F(xiàn)AT4蛋白在胰腺癌中的表達(dá)低于癌旁組織中FAT4的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

表2 FAT4在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá)Table 2 Expression of FAT4 protein in pancreatic cancer tissue and para－carcinoma tissue

2.3 FAT4蛋白與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3.1 FAT4蛋白不同表達(dá)水平胰腺癌患者的一般臨床情況 FAT4蛋白表達(dá)情況與患者臨床資料對比顯示，患者背痛在FAT4蛋白低表達(dá)和高表達(dá)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.042），患者性別、年齡、術(shù)前黃疸、術(shù)前空腹血糖差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）（表3）。

表3 FAT4蛋白表達(dá)與胰腺癌患者的一般臨床情況Table 3 Correlations between FAT4 expression and clinical features in pancreatic cancer patients

2.3.2 FAT4蛋白表達(dá)情況與病理學(xué)資料的關(guān)系 納入的79例患者均已行根治性手術(shù)治療，根據(jù)術(shù)后病理報(bào)告及免疫組化結(jié)果，收集完整臨床病理資料，分析與FAT4蛋白表達(dá)情況的關(guān)系。結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤在FAT4蛋白低表達(dá)與高表達(dá)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0．003、0．026）。其他臨床病理特征差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）（表4）。

表4 FAT4蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 4 Correlations between FAT4 expression and clinicopathological characteristics in pancreatic cancer patients

TNM分期和腫瘤分化程度是等級變量，采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)再次分析兩者與FAT4蛋白表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果提示FAT4蛋白表達(dá)與胰腺癌的TNM分期、分化程度無關(guān)（P值均＞0.05）（表5、6）。

表5 FAT4蛋白表達(dá)與TNM分期的關(guān)系Table 5 Correlations between FAT4 expression and TNM stage

3 討論

FAT基因最早由Mahoney等［2］在果蠅中發(fā)現(xiàn)，作為鈣黏蛋白基因超家族中的一員，編碼一個(gè)巨大的跨膜蛋白，起到抑癌基因的作用。FAT基因家族包括：FAT1、FAT2、FAT3和FAT4。國內(nèi)外對FAT基因家族的研究多著眼于FAT1和FAT4。

FAT1在不同腫瘤中雙向性表達(dá)，在不同類別的腫瘤中發(fā)揮截然不同的作用。FAT1基因在膠質(zhì)瘤中作為抑癌基因，經(jīng)過抑制Wnt/β－catenin通路，抑制癌細(xì)胞生長，通過突變使FAT1失活可以促進(jìn)Wnt信號傳導(dǎo)并影響患者生存［7］。同樣，F(xiàn)AT1失活后，乳腺癌、膽管癌細(xì)胞侵襲遷移得到促進(jìn)，但也有研究表明，F(xiàn)AT1在肝癌［8］和頭頸鱗癌［9］中起促癌基因作用。

不同于FAT1，F(xiàn)AT4主要發(fā)揮抑癌基因作用，在胃癌的研究［10］中，使用免疫組化法測定FAT4蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果提示FAT4在胃癌癌組織中低表達(dá)，與本研究結(jié)果在一定程度上相呼應(yīng)。為進(jìn)一步探索機(jī)制，使用FAT4－shRNA沉默F(xiàn)AT4，發(fā)現(xiàn)這種抑制導(dǎo)致磷酸化YAP增加和β－catenin的累積，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移，加速細(xì)胞周期，且FAT4沉默細(xì)胞化療耐藥性更高。現(xiàn)有研究推測，F(xiàn)AT4通過調(diào)節(jié)保持平面細(xì)胞極性、Hippo信號傳導(dǎo)途徑、經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)和YAP1表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和黏附。

表6 FAT4蛋白表達(dá)與腫瘤組織學(xué)類型的關(guān)系Table 6 Correlations between FAT4 expression and TNM stage

然而，在胰腺癌研究［11］中，僅檢測出FAT4基因在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)缺失，可能與啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)，但FAT4在胰腺癌組織和正常組織中表達(dá)是否有顯著差異，以及FAT4表達(dá)在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，尚無報(bào)道。

本研究的目的在于，通過免疫組織化學(xué)染色的方式，檢測FAT4蛋白在胰腺癌組織和對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，并初步探尋其臨床意義。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT4蛋白在胰腺癌中顯著低表達(dá)，分析FAT4蛋白在胰腺癌中表達(dá)情況和患者一般病例資料的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT4蛋白的表達(dá)與患者年齡、性別、黃疸有無、術(shù)前血糖情況無關(guān)，F(xiàn)AT4蛋白低表達(dá)與患者背痛癥狀發(fā)生相關(guān)。進(jìn)一步分析FAT4蛋白在胰腺癌中表達(dá)情況和患者臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT4的表達(dá)與患者腫瘤位置、腫瘤大小、TNM分期、分化程度無關(guān)，F(xiàn)AT4蛋白低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤相關(guān)。提示FAT4可能參與調(diào)控胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，也表明FAT4對胰腺癌的調(diào)控具有廣闊的研究前景和臨床應(yīng)用意義。

本研究中，F(xiàn)AT4蛋白表達(dá)雖然在不同TNM分期中表現(xiàn)出了一定的傾向性，但數(shù)據(jù)分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與本試驗(yàn)納入病例全為根治性手術(shù)切除病例有關(guān)，79例病例中，無Ⅳ期病例，Ⅲ期僅有6例，存在一定的選擇偏倚，為進(jìn)一步探究FAT4蛋白表達(dá)與胰腺癌TNM分期的相關(guān)性，應(yīng)進(jìn)一步放寬標(biāo)本入組標(biāo)準(zhǔn)，并且擴(kuò)大樣本量，再次分析驗(yàn)證結(jié)果。

本研究也存在其他不足之處，應(yīng)該進(jìn)一步使用Western blot檢測對FAT4蛋白表達(dá)進(jìn)行測定，同時(shí)，使用PCR驗(yàn)證FAT4 mRNA在胰腺癌中的表達(dá)，同時(shí)，應(yīng)該進(jìn)一步收集胰腺癌患者預(yù)后數(shù)據(jù)，通過生存分析，評估FAT4是否可以作為胰腺癌患者預(yù)后生存時(shí)間的預(yù)測指標(biāo)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張堯負(fù)責(zé)收集組織標(biāo)本、完成試驗(yàn)，撰寫論文；張鍇參與查閱文獻(xiàn)，指導(dǎo)試驗(yàn)、修改論文；馬超負(fù)責(zé)擬定寫作方向，指導(dǎo)撰寫文章并最終定稿。