白麗娜，劉 穎，唐春曉，樸紅心，林貞花，楊萬山，金愛花，2b

1延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究中心，吉林 延吉 133000；2延邊大學(xué)附屬醫(yī)院a.感染性疾病科，b.消化內(nèi)科，吉林 延吉 133000

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，其在我國發(fā)病率上升至第9位，死亡率位居第6位，5年生存率僅為7.2%［1－2］。由于PC發(fā)病隱匿和早期診斷困難等因素，約80%的患者確診時已為晚期，錯過最佳手術(shù)機(jī)會［3－4］。對于無法手術(shù)治療及術(shù)后轉(zhuǎn)移的晚期患者，化療是主要的治療方式，但化療引起的不良反應(yīng)導(dǎo)致患者生存質(zhì)量嚴(yán)重下降［5］。因此，尋找具有良好抗腫瘤活性、較強(qiáng)組織滲透性和毒副作用小的抗PC藥物是臨床亟待解決的重要問題。

可利霉素（Carrimycin）是我國首次利用合成生物學(xué)技術(shù)自主研發(fā)的基因工程藥物，擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)，于2019年6月批準(zhǔn)上市［6］。最新研究［7］發(fā)現(xiàn)，可利霉素中的主要成分異戊螺旋霉素Ⅰ可抑制肝癌細(xì)胞的腫瘤生長，并初步揭示其通過下調(diào)細(xì)胞程序性死亡配體1表達(dá)抑制肝癌增殖、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。Liang等［8］的研究結(jié)果也顯示，可利霉素在體內(nèi)和體外均能抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞生物學(xué)活性。但其在PC惡性進(jìn)展中是否發(fā)揮類似的抗癌作用仍有待闡釋。為此，本研究旨在探究可利霉素對PC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，從而為其在PC中的治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 PC細(xì)胞株MIA PaCa－2、BxPC－3、Panc－1和PATU 8988均由延邊大學(xué)腫瘤研究中心提供。

1.1.2 主要試劑 DMEM液體培養(yǎng)基（C11330500BT）、胎牛血清（10100147）和胰蛋白酶（25200－072）均購自美國GIBCO公司；可利霉素（國藥準(zhǔn)字號：H20190029）購自上海同聯(lián)制藥有限公司；青霉素/鏈霉素（15140－122）購自美國GIBCO公司；超敏ExPlus ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（ZD310A）購自莊盟生物科技有限公司；EdU（5－Ethynyl－2’－deoxyuridine）試劑盒（C10310）購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（D8371）與四甲基偶氮唑鹽［3－（4，5－dimethylthiazol－2－yl）－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT］（M8180）購自北京索萊寶生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（CW0014）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；兔抗上皮鈣黏素（E－cadherin）（ab15148）抗體購自美國Abcam公司；兔抗鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail）（sc－271977）購自美國Santa－Cruz公司；小鼠抗波形蛋白（Vimentin）（V6389）抗體購自美國Millipore公司；小鼠β－肌動蛋白（CW0096M）抗體購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A（P21）（28248－1－AP）購自美國Proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（ZB－2301）和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（ZB－2305）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔熒光二抗Alexa Fluor 488（A－11034）和山羊抗小鼠熒光二抗Alexa Fluor 568（A－11004）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（FormaTM系列Ⅱ3110）購自美國Thermo公司；臺式微量冷凍離心機(jī)（CT15RE）購自日本日立公司；全波長多功能酶標(biāo)儀（Spark）購自瑞士Tecan公司；光學(xué)倒置顯微鏡（IX71）購自日本Olympus公司；熒光正置顯微鏡（BX53）購自日本Olympus公司；垂直電泳儀（PowerPac系列）購自美國BioRad公司；電轉(zhuǎn)儀（全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)1704150）購自美國BioRad公司；ChemiDoc成像系統(tǒng)（1708280）購自美國BioRad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將MIA PaCa－2、BxPC－3、Panc－1和PATU 8988細(xì)胞培養(yǎng)在含100 mL/L胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM液體培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞長至90%時，以1∶3的比例進(jìn)行傳代，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT實驗 將細(xì)胞常規(guī)消化、離心后以MIA PaCa－2每孔5×103個/100μL、BxPC－3每孔2×103個/100μL、Panc－1每孔3×103個/100μL和PATU 8988每孔5×103個/100μL的細(xì)胞數(shù)種植于96孔板中，每孔補充培養(yǎng)基至200μL，待細(xì)胞貼壁后，加入濃度為0、2、4、8和16μmol/L的可利霉素，每個藥物濃度設(shè)置5個平行復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入20μL（5 mg/mL）MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去上清液，每孔內(nèi)加入100μL的DMSO，震蕩10 min之后，使用全波長酶標(biāo)儀于570 nm波長測定各培養(yǎng)孔的吸光值（A）。根據(jù)公式計算細(xì)胞生存率（%）＝（可利霉素處理組吸光值/對照組吸光值）×100%，并繪制細(xì)胞增殖曲線計算半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

1.2.3 細(xì)胞分組 取對數(shù)生長期MIA PaCa－2、BxPC－3、Panc－1和PATU 8988細(xì)胞加入不同濃度可利霉素組，進(jìn)行MTT實驗篩選細(xì)胞株。依據(jù)MTT實驗結(jié)果選擇BxPC－3和MIA PaCa2兩種細(xì)胞系在4、8和16μmol/L用藥濃度和48 h用藥時間進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4 EdU細(xì)胞增殖檢測實驗 將生長對數(shù)期細(xì)胞常規(guī)消化、離心后以MIA PaCa－2每孔1×104個/100μL、BxPC－3每孔5×103個/100μL的細(xì)胞數(shù)種植于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后分別加入0、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細(xì)胞48 h，然后每孔加入100μL 50μmol/L EdU，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。PBS洗滌細(xì)胞2次，加入50μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，每孔加入50μL 2 mg/mL甘氨酸溶液搖床孵育5 min，PBS洗滌5 min，再加入100μL 0.5%Triton X－100搖床孵育10 min。再次洗滌細(xì)胞后每孔加入100μL 1×Apollo染色反應(yīng)液后室溫避光搖床孵育30 min，棄染色反應(yīng)液。洗滌細(xì)胞后每孔加入1×Hoechst33342反應(yīng)液100μL，室溫避光孵育30 min。再次洗滌后每孔加入100μL PBS，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 集落形成實驗 常規(guī)消化細(xì)胞后接種于6孔板，每孔接種1000個細(xì)胞，分別加入濃度為0、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2周，當(dāng)細(xì)胞生長至肉眼可見的細(xì)胞集落時，終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，蘇木素染色30 min，棄蘇木素，蒸餾水返藍(lán)后于室溫下干燥，計數(shù)每孔集落形成數(shù)目。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測 取對數(shù)生長期且生長良好的MIA PaCa－2和BxPC－3細(xì)胞，常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度為0（對照組）、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細(xì)胞48 h后常規(guī)消化，收集細(xì)胞懸液，用預(yù)冷PBS洗滌2次，再加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過夜。次日細(xì)胞離心、預(yù)冷PBS重懸后，每管加入1.5 mL PI染色液輕輕重懸均勻，37℃水浴鍋中避光孵育30 min后上機(jī)檢測。

1.2.7 細(xì)胞劃痕愈合實驗 常規(guī)消化細(xì)胞并等量接種于6孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到80%時，使用無菌槍頭在單層細(xì)胞上垂直劃痕。用PBS清洗漂浮的細(xì)胞后，分別加入濃度為0、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細(xì)胞，分別培養(yǎng)0、12、24和48 h后觀察并拍照。

1.2.8 免疫蛋白印跡法（Western blot） 用藥處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，加入裂解液提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白的濃度。各組蛋白取30μg樣本進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉1 h后，與一抗在4℃孵育過夜。次日用TBS－T洗膜，TBS－T稀釋二抗，于低速搖床上室溫孵育2 h后，用ECL法顯影、曝光，最后用Image J統(tǒng)計結(jié)果并分析。

1.2.9 免疫熒光染色實驗 將細(xì)胞置于6孔板中培養(yǎng)48 h后，依次進(jìn)行PBS洗滌、多聚甲醛固定、Triton－100透化、胎牛血清封閉后，以1∶100的比例稀釋兔抗Ecadherin抗體、小鼠抗Vimentin抗體。一抗4℃孵育過夜。次日，PBS洗滌后，以1∶400的比例稀釋山羊抗兔熒光二抗或山羊抗小鼠熒光二抗，室溫避光孵育2 h。PBS洗滌后，滴入含DAPI的封片劑封片。于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本實驗的結(jié)果均采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD－t檢驗。所有實驗均重復(fù)3次或3次以上。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 可利霉素抑制PC細(xì)胞的增殖活性 為了觀察可利霉素對PC細(xì)胞增殖活性的影響，MTT實驗檢測以0、2、4、8和16μmol/L的可利霉素處理PC細(xì)胞MIA PaCa－2、BxPC－3、Panc－1和PATU 8988于24、48和72 h后細(xì)胞的增殖活力，結(jié)果顯示：可利霉素可抑制PC細(xì)胞的增殖活性，且隨著藥物濃度的升高和用藥時間的延長，細(xì)胞活性逐漸降低，并呈藥物濃度與時間依賴性（P值分別＜0.01、＜0.001、＜0.0001）（圖1）；應(yīng)用Graphpad Prism 8.0軟件計算得出可利霉素處理PC細(xì)胞48 h后MIA PaCa－2細(xì)胞的IC50值為6.67μmol/L；BxPC－3細(xì)胞的IC50值為5.76μmol/L；Panc－1細(xì)胞的IC50值為8.62μmol/L；PATU 8988細(xì)胞的IC50值為7.47μmol/L。根據(jù)這一結(jié)果，將選取MIA PaCa－2和BxPC－3細(xì)胞，0、4、8和16μmol/L用藥濃度和48 h用藥時間進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 MTT法檢測0、2、4、8和16μmol/L的可利霉素對PC細(xì)胞系的細(xì)胞增殖活性。Figure 1 Cell viabilityof PC cells treated by Carrimycin for 0，2，4，8 and 16μmol/L was measured by MTT assay

2.2 可利霉素抑制PC細(xì)胞的增殖和克隆形成能力 EdU細(xì)胞增殖實驗結(jié)果（圖2a）顯示：4、8、16μmol/L可利霉素分別與對照組比較，可顯著降低PC細(xì)胞MIA PaCa－2（t值分別為2．378、4．984、18．970，P值分別為＜0.05、＜0.01、＜0.000 1）及BxPC－3（t值分別為4.879、6．089、9．521，P值分別為＜0.01、＜0.001、＜0.000 1）的DNA復(fù)制能力；集落形成實驗結(jié)果（圖2b）表明，4、8、16μmol/L可利霉素處理PC細(xì)胞14 d后，分別與對照組比較，MIA PaCa－2（t值分別為5．889、11．240、15．840，P值分別為＜0．001、＜0．000 1、＜0.000 1）和BxPC－3（t值分別為6．717、15．800、18．850，P值分別為＜0．001、＜0．000 1、＜0．000 1）細(xì)胞的集落形成能力隨著藥物濃度的增加而明顯減少。以上結(jié)果提示，可利霉素能夠抑制PC細(xì)胞的增殖能力。

2.3 可利霉素促進(jìn)PC細(xì)胞周期阻滯 通過流式細(xì)胞術(shù)分析可利霉素是否通過調(diào)控細(xì)胞周期抑制PC細(xì)胞的增殖，結(jié)果（圖3a）顯示：與對照組比較，4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa－2細(xì)胞G1期比例（t值分別為9．071、12．280、19．360，P值均＜0.000 1）及BxPC－3細(xì)胞G1期比例（t值分別為3.061、4．962、8．868，P值分別為＜0.05、＜0.01、＜0.000 1）均增加，MIA PaCa－2細(xì)胞S期比例（t值分別為2．316、4．165、5．562，P值分別為＜0．05、＜0．01、＜0.001）及BxPC－3細(xì)胞S期比例（t值分別為2.424、3．264、5．744，P值分別為＜0.05、＜0.05、＜0.001）均降低。Western blot實驗（圖3b）進(jìn)一步證實，與對照組比較，周期相關(guān)蛋白P21在MIA PaCa－2（t值分別為5．437、6．453、8．799，P值分別為＜0．001、＜0.001、＜0．000 1）和BxPC－3細(xì)胞（t值分別為25．13、44．75、52.96，P值均＜0．000 1）中的表達(dá)水平隨可利霉素用藥濃度增加而逐漸上調(diào)。上述結(jié)果表明，可利霉素促進(jìn)G1期細(xì)胞周期阻滯、上調(diào)P21表達(dá)抑制PC細(xì)胞的增殖。

圖3 細(xì)胞周期和Western Blot實驗檢測不同濃度的可利霉素對MIA PaCa－2和BxPC－3細(xì)胞周期的影響Figure 3 Cell cycle and Western Blot experiments were performed to examine the effects of different concentrations of Carrimycin on the cell cycle of MIA PaCa－2 and BxPC－3 cells

2.4 可利霉素抑制PC細(xì)胞的遷移和上皮細(xì)胞－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）進(jìn)程 劃痕愈合實驗結(jié)果（圖4a、b和表1）顯示，0和4、8、16μmol/L可利霉素處理12、24和48 h PC細(xì)胞MIA PaCa－2（P值分別為＜0.05、＜0.01、＜0.001、＜0.000 1）及BxPC－3（P值分別為＜0.05、＜0.001、＜0.000 1）的橫向遷移能力明顯減弱。Western Blot實驗結(jié)果（圖4c）顯示，與對照組比較，4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa－2（t值分別為2．388、4．899、5．819，P值分別＜0.05、＜0.01、＜0.001）及BxPC－3細(xì)胞（t值分別為2．533、5．836、6.774，P值分別＜0．05、＜0．001、＜0．001）中上皮標(biāo)志物E－cadherin的表達(dá)明顯上調(diào)，同樣地，4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa－2（t值分別為12．440、14．830、16．800，P值均＜0．000 1）及BxPC－3細(xì)胞（t值分別為5．039、5.893、7.725，P值分別為＜0．01、＜0．001、＜0．000 1）中間質(zhì)標(biāo)志物Snail的表達(dá)水平顯著下調(diào)，4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa－2（t值分別為3．105、7．752、11．200，P值分別為＜0．05、＜0．000 1、＜0．000 1）及BxPC－3細(xì)胞（t值分別為2.555、4．883、9．153，P值分別為＜0．05、＜0．01、＜0．000 1）中間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)水平也顯著下調(diào)；與上述結(jié)果一致，免疫熒光結(jié)果（圖4d）進(jìn)一步亦證實，可利霉素處理組的E－cadherin熒光信號明顯增強(qiáng)，而Vimentin的熒光信號則明顯減弱。這些結(jié)果表明，可利霉素通過EMT進(jìn)程抑制PC細(xì)胞的遷移。

圖4 不同濃度的可利霉素對MIA PaCa－2和BxPC－3細(xì)胞遷移及EMT進(jìn)程的影響Figure 4 Effects of different concentrations of Carrimycin on migration and EMT progression of MIA PaCa－2 and BxPC－3 cells

表1 不同濃度的可利霉素對MIA PaCa－2細(xì)胞和BxPC－3細(xì)胞遷移的影響Table 1 Effect of carrimycin at different concentrations on the migration of MIA PaCa－2 cells and BxPC－3 cells migration

3 討論

在腫瘤治療過程中，隨著抗癌藥物的廣泛應(yīng)用，腫瘤細(xì)胞對其產(chǎn)生不可忽視的耐藥性，致使人們對不同藥物重新定位，挖掘潛在的臨床價值。令人鼓舞的是，許多臨床批準(zhǔn)的非癌癥藥物在生物學(xué)實驗中甚至臨床上都顯示出較好的抗腫瘤活性，其中關(guān)于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的相關(guān)研究較多。例如，大環(huán)內(nèi)酯類藥物雷帕霉素能抑制PC、肝癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，并能促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤形成［9］。有研究［10－12］報道顯示，大環(huán)內(nèi)酯類化合物埃博霉素與微管蛋白結(jié)合，影響腫瘤細(xì)胞的有絲分裂過程，進(jìn)而抑制腫瘤生長?？衫顾刈鳛橐环N大環(huán)內(nèi)酯類抗生素新藥，不僅具有良好的抗菌效果，還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖及其轉(zhuǎn)移的作用［13］。后續(xù)研究［7］發(fā)現(xiàn)，可利霉素可通過抑制PI3K/mTOR信號通路，降低IL－6和IL－8水平，抑制腫瘤細(xì)胞細(xì)胞程序性死亡－配體1的表達(dá)，從而抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞特異性活化，繼而發(fā)揮抑癌作用，還具備誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能。但其具體抑癌機(jī)制尚不明確。為此，本研究主要探討大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可利霉素對PC細(xì)胞體外增殖及轉(zhuǎn)移能力是否有抑制作用，并進(jìn)一步研究其可能的機(jī)制，為今后治療PC提供新思路。

腫瘤細(xì)胞異常增殖是促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的重要因素，因此，抑制腫瘤細(xì)胞增殖能有效調(diào)控癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程。本研究利用濃度和時間梯度可利霉素處理PC細(xì)胞，觀測可利霉素對PC細(xì)胞活力、增殖及細(xì)胞周期的影響。研究結(jié)果顯示，可利霉素隨著藥物濃度的增加和用藥時間的延長能有效抑制PC細(xì)胞的體外增殖、集落形成能力及DNA復(fù)制能力并誘導(dǎo)PC細(xì)胞周期阻滯于G1期，進(jìn)一步的Western Blot實驗證實了細(xì)胞周期相關(guān)標(biāo)志蛋白P21的表達(dá)隨可利霉素用藥濃度增加而逐漸上調(diào)，上述結(jié)果均可表明可利霉素能夠抑制PC細(xì)胞的增殖能力。這與Jin等［7］和Liang等［8］的研究結(jié)果相一致。

有報道［14］證實EMT進(jìn)程是參與胰腺炎向PC轉(zhuǎn)變以及PC轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。當(dāng)腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程得到促進(jìn)時，下調(diào)上皮標(biāo)志物E－cadherin蛋白和過量表達(dá)間質(zhì)標(biāo)志物Snail與Vimentin蛋白，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的運動能力變強(qiáng)，進(jìn)而在宏觀上表現(xiàn)為癌癥全身轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，從而加劇了腫瘤的治療難度［15－17］。因此，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，抑制或逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程對幫助腫瘤患者抑制疾病和治療疾病等均起著重要作用。于是通過劃痕愈合實驗、Western Blot和免疫熒光實驗研究可利霉素對PC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，可利霉素呈濃度和時間依賴性的方式抑制PC細(xì)胞的遷移，同時上調(diào)上皮標(biāo)志物E－cadherin的表達(dá)，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物Snail和Vimentin的表達(dá)水平，提示可利霉素可通過逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程抑制PC細(xì)胞的遷移能力。而PC的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因參與、多因素影響的多步驟復(fù)雜過程［18］，對于EMT進(jìn)程在侵襲轉(zhuǎn)移中的機(jī)制及可能存在的其他與轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路還有待進(jìn)一步發(fā)掘和探討。

綜上所述，可利霉素可通過有效抑制PC細(xì)胞的增殖和遷移等生物學(xué)進(jìn)程發(fā)揮其抗腫瘤的生物學(xué)活性。并且深入探究可利霉素在PC發(fā)生與發(fā)展過程中的作用及機(jī)制，可為PC的治療進(jìn)一步提供基礎(chǔ)研究和新的希望，但可利霉素抑制PC細(xì)胞可能涉及多條信號通路，其具體的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用仍需更深入地研究探討。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：白麗娜負(fù)責(zé)實驗設(shè)計、實施、論文撰寫及數(shù)據(jù)分析；劉穎、唐春曉負(fù)責(zé)實驗設(shè)計、實施及論文修改；楊萬山負(fù)責(zé)實驗設(shè)計與論文修改；金愛花、樸紅心、林貞花負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。