程齊齊,楊麗霞,蔡天盼,王 亮,孫 俊,梁佳圓,劉麗萍,甘 廈,阮寧杭,葛善飛
1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.感染性疾病科,b.信息處,南昌 330006;2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院,南昌 330031
慢性乙型肝炎(CHB)是由HBV持續(xù)感染引起的肝臟慢性炎癥性疾病。全世界約有2.57億人感染HBV[1],我國(guó)HBV感染者高達(dá)普通人群的10%[2],而CHB患者約有3000萬(wàn)人[3]。因此,CHB仍是我國(guó)乃至全球肝臟疾病相關(guān)死亡率的主要原因??共《局委熓荂HB的核心治療,核苷(酸)類似物(NAs)抗病毒效果強(qiáng)、服用方便且不良反應(yīng)少,在臨床上被廣泛應(yīng)用,但因其不能直接作用于肝細(xì)胞核內(nèi)的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA),導(dǎo)致HBV感染難以完全治愈。隨著HBV DNA檢測(cè)靈敏度不斷的提高,許多既往認(rèn)為獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)的患者經(jīng)高敏HBV DNA檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)血清HBV DNA呈低水平復(fù)制,即低病毒血癥(low-level viremia,LLV)?,F(xiàn)有的研究[4-7]發(fā)現(xiàn),LLV可引起耐藥、病毒學(xué)突破,甚至與肝纖維化、肝硬化以及肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。目前關(guān)于LLV預(yù)測(cè)模型及HBV血清學(xué)標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化研究較少。本研究旨在通過回顧性分析NAs初治的CHB患者的臨床資料,明確LLV發(fā)生的影響因素以及治療期間患者的血清病毒學(xué)指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化。
1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2020年11月—2022年3月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科門診就診的CHB患者。納入標(biāo)準(zhǔn):所有CHB患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019版)》[8];接受一線NAs抗病毒治療至少12個(gè)月;基線HBV DNA≥2000 IU/mL。排除標(biāo)準(zhǔn):同時(shí)合并其他類型肝炎病毒、HIV、EB病毒等;合并自身免疫性疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病等;至2022年3月,HBV DNA≥2000 IU/mL的患者;依從性差的患者;HBV耐藥突變的患者;基線資料或動(dòng)態(tài)資料不全的患者。
1.2 研究方法 根據(jù)CHB患者治療期間的HBV DNA水平,將患者分為SVR組和LLV組。SVR組的定義是在達(dá)到了完全病毒學(xué)應(yīng)答后,HBV DNA持續(xù)檢測(cè)不到(<20 IU/mL);LLV組的定義為接受一線抗病毒藥物治療至少48周,患者血清HBV DNA持續(xù)性或間歇性可檢測(cè)到(≥20 IU/mL,但<2000 IU/mL)[9]。
1.3 觀察指標(biāo) 收集患者的一般資料,包括性別、年齡、BMI、家族史、有無(wú)肝硬化、有無(wú)代謝相關(guān)性脂肪性肝?。∕AFLD);NAs類型包括恩替卡韋(ETV)、富馬酸替諾福韋(TDF)和富馬酸丙酚替諾福韋(TAF);實(shí)驗(yàn)室指標(biāo):基線及12、24、36及48周HBV DNA、HBsAg定量等HBV血清學(xué)標(biāo)志物、肝腎功能、血常規(guī);影像學(xué)指標(biāo):腹部彩超、LSM等。高敏HBV DNA定量檢測(cè)采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR(儀器:美國(guó)羅氏480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀),檢測(cè)下限為20 IU/mL。血清HBV標(biāo)志物采用的是美國(guó)雅培公司Abbott ARCHITECT儀器及試劑分析。血常規(guī)、血生化等指標(biāo)均在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0和MedCalc 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理,Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);非正態(tài)分布的計(jì)量資料用M(P25~P75)表示,兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。多因素二元Logistic回歸分析CHB患者發(fā)生LLV的獨(dú)立影響因素,并建立預(yù)測(cè)模型,采用Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)評(píng)估模型的擬合度,運(yùn)用受試者工作特征曲線(ROC曲線)并計(jì)算曲線下面積(AUC)評(píng)估相關(guān)因素及模型對(duì)CHB患者發(fā)生LLV的預(yù)測(cè)價(jià)值。采用Kaplan-Meier分析HBV DNA累積陰轉(zhuǎn)率,應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析比較兩組間或組內(nèi)0、12、24、36、48周HBV DNA和HBsAg水平及其變化的差異。HBV DNA及HBsAg定量進(jìn)行l(wèi)g轉(zhuǎn)化。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 一般資料 本研究共納入CHB患者78例,SVR組58例(74.4%),LLV組20例(25.6%)?;颊叨酁槟行裕?9.2%),年齡29~39歲,中位年齡32歲。LLV組HBeAg陽(yáng)性率、HBV DNA、HBsAg水平高于SVR組,年齡、ALT、AST、LSM低于SVR組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。
2.2 CHB患者發(fā)生LLV多因素分析及預(yù)測(cè)模型建立 將單因素分析(表1)中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入多因素Logistic回歸分析,使用BOX-Tidwell方法檢驗(yàn)自變量與因變量的logit轉(zhuǎn)換值之間是否存在線性關(guān)系,運(yùn)用容忍度、方差膨脹因子檢驗(yàn)自變量之間的多重共線性,結(jié)果顯示容差值均0.1~1.0,VIF值均<10,表明所納入的自變量之間不存在共線性。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,基線HBV DNA(OR=2.365,95%CI:1.220~4.587,P=0.011)、基線HBsAg(OR=4.229,95%CI:1.098~16.287,P=0.036)是影響CHB患者發(fā)生LLV的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,而ALT(OR=0.965,95%CI:0.937~0.994,P=0.018)是獨(dú)立保護(hù)性因素。根據(jù)多因素分析結(jié)果,將HBV DNA、HBsAg和ALT再次行二元Logistics回歸分析,根據(jù)回歸系數(shù)作為危險(xiǎn)因素的權(quán)重(表2),建立CHB患者發(fā)生LLV的預(yù)測(cè)模型(MLLV),計(jì)算公式為:Logit(MLLV)=-8.668+1.441×lgHBsAg+0.598×lgHBV DNA-0.016×ALT,LLV發(fā)生概率P=elogit(MLLV)/(1+elogit(MLLV))?;貧w模型系數(shù)的綜合檢驗(yàn)結(jié)果顯示P<0.001,采用Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn),結(jié)果顯示χ2=11.625,P=0.169,表明模型與觀察值擬合度較好(圖1)。
表2 MLLV模型的建立Table 2 Establishment of the MLLV model
圖1 Logistic回歸模型的校準(zhǔn)度Figure 1 Calibration curve of logistic regression model
表1 CHB患者基線臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)分析Table 1 Analysis of baseline clinical characteristics and laboratory indexes of CHB patients
2.3 MLLV模型預(yù)測(cè)價(jià)值的分析 通過繪制HBV DNA、HBsAg、ALT和MLLV模型的ROC曲線,分析各指標(biāo)和模型的預(yù)測(cè)價(jià)值(表3,圖2)。結(jié)果顯示,MLLV模型預(yù)測(cè)CHB患者發(fā)生LLV的AUC值明顯大于HBV DNA、HBsAg、ATL單獨(dú)預(yù)測(cè)的AUC值。MLLV模型的最佳截?cái)嘀禐?.44,對(duì)應(yīng)的敏感度為85.00%,特異度為93.10%,AUC值為0.931,95%CI為0.850~0.976,提示該模型具有較好的預(yù)測(cè)效能(P<0.001)。
圖2 HBV DNA、HBsAg、ALT和MLLV模型的ROC曲線Figure 2 ROC curve of HBV DNA,HBsAg,ALT and MLLV models
2.4 不同基線HBV DNA和HBsAg的CHB患者DNA累積陰轉(zhuǎn)率 根據(jù)基線HBVDNA的截?cái)嘀担ū?)將患者分為HBV DNA>7.29 lgIU/mL組和HBV DNA≤7.29 lgIU/mL組,進(jìn)一步使用二元Logistic回歸分析,結(jié)果提示基線HBV DNA>7.29 lgIU/mL的患者LLV的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是基線HBV DNA≤7.29 lgIU/mL患者的8.944倍(P<0.001);同樣對(duì)根據(jù)HBsAg截?cái)嘀捣纸M的患者進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)HBsAg>4.38 lgIU/mL患者LLV的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是HBsAg≤4.38 lgIU/mL患者的35.417倍(P<0.001)。進(jìn)一步使用Kaplan-Meier曲線分析不同基線HBV DNA的CHB患者的HBV DNA累積陰轉(zhuǎn)率,發(fā)現(xiàn)隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng),兩組患者HBV DNA的陰轉(zhuǎn)率逐漸提高,但基線HBV DNA<7.29 lgIU/mL組患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)率始終高于另一組(χ2=22.52,P<0.001)(圖3a);同樣使用Kaplan-Meier曲線分析不同基線HBsAg的CHB患者HBV DNA的累積陰轉(zhuǎn)率,結(jié)果顯示,基線HBsAg≤4.38 lgIU/mL組患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)率始終高于另一組(χ2=26.35,P<0.001)(圖3b)。
圖3 不同基線HBV DNA和HBsAg的CHB患者HBV DNA累積轉(zhuǎn)陰率Figure 3 Cumulative negative rate of HBV DNA in CHB patients with different baseline HBV DNA and HBsAg
表3 HBV DNA、HBsAg、ALT和MLLV對(duì)LLV發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值Table 3 Predictive value of HBV DNA,HBsAg,ALT and MLLV for the occurrence of LLV
2.5 治療期間HBV DNA、HBsAg動(dòng)態(tài)變化分析 CHB患者治療期間HBV DNA、HBsAg水平均逐漸下降(圖4),呈先快后慢的趨勢(shì),HBV DNA在第12周下降幅度最大[(3.07±1.39)lgIU/mL],在治療12周后下降幅度逐漸減?。▓D5a),而HBsAg在第24周下降幅度最大[(0.77±0.32)lgIU/mL](圖5b)。
圖4 兩組患者HBV DNA和HBsAg水平變化Figure 4 Dynamic changes of HBV DNA and HBsAg in two groups
圖5 所有患者HBV DNA和HBsAg下降幅度變化Figure 5 The decrease range changes of HBV DNA and HBsAg
LLV組和SVR組患者隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng),HBV DNA和HBsAg水平均持續(xù)下降,組內(nèi)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表4),且LLV組患者在治療基線、12周、24周、36周、48周時(shí)的HBV DNA和HBsAg水平始終高于SVR組(P值均<0.05)。LLV組在第12周和第24周時(shí)的HBV DNA下降幅度分別為(3.27±1.07)lgIU/mL、(4.41±1.36)lgIU/mL,而SVR組第12周和第24周時(shí)的HBV DNA下降幅度分別為(3.01±1.49)lgIU/mL、(3.80±1.49)lgIU/mL,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。對(duì)兩組在第12周和第24周的HBsAg下降幅度進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。
表4 CHB患者治療期間HBV DNA和HBsAg動(dòng)態(tài)變化Table 4 Dynamic changes of HBV DNA level and HBsAg level in CHB patients during treatment
HBV感染是我國(guó)終末期肝病發(fā)生的主要原因,而口服NAs仍是抗病毒治療的主要方法,一些具有強(qiáng)效抑制病毒和低耐藥的藥物,如ETV、TDF、TAF,已被推薦為一線用藥[10-11]。然而,隨著核酸檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步,HBV DNA的檢測(cè)下限逐漸被突破,越來(lái)越多的患者在抗病毒治療過程中檢測(cè)到HBV DNA呈低水平復(fù)制。日本學(xué)者[12]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)ETV治療48周的CHB患者,約19.9%的患者HBV DNA陽(yáng)性,而TDF和TAF單藥治療的患者HBV DNA陽(yáng)性率分別為21.2%和21.5%[13]。其他真實(shí)世界的研究表明,即使是使用一線抗病毒藥物,仍有20%~40%的患者會(huì)發(fā)生LLV[6,14-15],本研究中CHB患者的LLV發(fā)生率為25.6%,與既往臨床研究結(jié)果大致相符。目前,關(guān)于NAs經(jīng)治的CHB患者發(fā)生LLV的機(jī)制尚未完全明確,可能的機(jī)制有:(1)NAs藥物競(jìng)爭(zhēng)性抑制的局限性;(2)宿主免疫功能較弱或未恢復(fù);(3)部分患者肝細(xì)胞處于增殖不活躍狀態(tài)[15]。
ALT水平可反應(yīng)宿主免疫狀態(tài),在宿主對(duì)感染肝細(xì)胞的免疫清除過程中,ALT隨著免疫反應(yīng)的增強(qiáng)而逐漸升高,因此高水平的ALT是宿主免疫活躍的標(biāo)志。有文獻(xiàn)[16]報(bào)道,NAs治療的CHB患者ALT在正常范圍內(nèi)或處于低水平可能與LLV的發(fā)生相關(guān)。另有研究[17]發(fā)現(xiàn),ALT>2倍正常值上限(ULN)的CHB患者經(jīng)NAs治療后HBV DNA下降的比例高于ALT在1.3~2×ULN的患者。本研究結(jié)果顯示,達(dá)到SVR的患者在接受NAs抗病毒治療時(shí)的ALT水平>2×ULN,明顯高于發(fā)生LLV的患者,說明接受抗病毒治療時(shí)高水平的ALT是發(fā)生LLV的保護(hù)性因素(OR=0.965,95%CI:0.937~0.994,P=0.018)。因此,基線高ALT的CHB患者接受抗病毒治療后可能會(huì)獲得更好的病毒學(xué)應(yīng)答效果。
HBV DNA可直接反映CHB患者體內(nèi)病毒復(fù)制水平,在患者治療和隨訪過程中具有非常重要的作用。一項(xiàng)納入875例CHB患者的研究[9]結(jié)果顯示基線HBV DNA水平與LLV相關(guān)。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)基線高水平HBV DNA(>6 lgIU/L)時(shí)LLV發(fā)生率明顯高于基線HBV DNA≤6 lgIU/L患者。本研究中,LLV組患者基線HBV DNA水平顯著高于SVR組,基線HBV DNA是LLV發(fā)生獨(dú)立危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步對(duì)HBV DNA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)基線HBV DNA>7.29 lgIU/mL時(shí),HBV DNA陰轉(zhuǎn)率會(huì)降低,而LLV發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)將增加8倍以上,提示基線HBV DNA水平越高,發(fā)生LLV風(fēng)險(xiǎn)越大。
HBsAg作為HBV感染的重要標(biāo)志物在臨床上廣泛應(yīng)用,HBV感染的不同階段,HBsAg水平差別甚大。有研究[19]認(rèn)為HBsAg是以cccDNA模板合成的,可在一定程度上反映HBV的復(fù)制情況。本研究對(duì)CHB患者的HBsAg與LLV的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),基線高水平HBsAg是LLV發(fā)生獨(dú)立危險(xiǎn)因素,HBsAg越高,HBV DNA陰轉(zhuǎn)率會(huì)降低,LLV發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高。這與其他研究的結(jié)果大致相同[20-21]。
HBeAg作為HBV核心基因的一部分,是HBV復(fù)制的重要指標(biāo)。有研究[22]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期ETV經(jīng)治的CHB患者中LLV患者的陽(yáng)性率為88.2%,本研究中LLV組患者HBeAg的陽(yáng)性率達(dá)90%,與既往研究大致相符。Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)基線HBeAg陽(yáng)性是長(zhǎng)期ETV經(jīng)治CHB患者發(fā)生LLV的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,陳賀等[22]研究也得出此結(jié)論。本研究結(jié)果顯示,HBeAg陽(yáng)性并非CHB患者發(fā)生LLV的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,與上述文獻(xiàn)觀點(diǎn)有所不同,考慮與本研究中HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性患者的基線ALT水平[127.5(54.0~217.0)U/L vs 111.4(44.3~230.0)U/L]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.214,P=0.225),兩組患者所處的免疫狀態(tài)有關(guān),其次可能與樣本量較少有關(guān)。
關(guān)于LLV發(fā)生預(yù)測(cè)模型的研究較少,本研究以HBV DNA、HBsAg和ALT構(gòu)建了LLV發(fā)生的預(yù)測(cè)模型MLLV,結(jié)果顯示MLLV預(yù)測(cè)效能最高(AUC=0.931),敏感度、特異度分別為85.00%、93.10%,為L(zhǎng)LV的發(fā)生提供了簡(jiǎn)捷、可靠的預(yù)測(cè)模型,該模型以反映HBV復(fù)制及肝臟炎癥為基礎(chǔ)構(gòu)建,可較客觀呈現(xiàn)CHB患者肝細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制和肝臟損傷情況,對(duì)CHB患者抗病毒治療的預(yù)后有一定的參考價(jià)值。進(jìn)一步對(duì)CHB患者血清HBV DNA及HBsAg的動(dòng)態(tài)變化分析發(fā)現(xiàn),抗病毒治療過程中HBV DNA和HBsAg都呈逐漸下降趨勢(shì),但發(fā)生LLV的患者HBV DNA及HBsAg水平始終高于SVR患者,隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng),兩者下降的速度也逐漸減慢。Lim等[23]研究發(fā)現(xiàn),使用NAs抗病毒治療過程中,HBsAg動(dòng)態(tài)變化是HBsAg清除的有力預(yù)測(cè)因子。因此,對(duì)CHB患者在抗病毒治療過程中監(jiān)測(cè)血清HBV DNA及HBsAg的動(dòng)態(tài)變化具有重要的意義。
綜述所述,基線HBV DNA、HBsAg和ALT是NAs治療的CHB患者發(fā)生LLV的獨(dú)立影響因素,以此建構(gòu)的預(yù)測(cè)模型可以較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)LLV的發(fā)生發(fā)展。此外,HBV DNA、HBsAg的動(dòng)態(tài)變化對(duì)CHB患者抗病毒治療具有一定的指導(dǎo)作用。但本研究樣本量較少,只構(gòu)建了預(yù)測(cè)模型,尚未能進(jìn)行驗(yàn)證模型驗(yàn)證,下一步將擴(kuò)大樣本量,驗(yàn)證該模型及結(jié)論,積極探討LLV的干預(yù)措施,并進(jìn)一步探究其發(fā)生的機(jī)制,為L(zhǎng)LV患者的管理提供參考。
倫理學(xué)聲明:本研究于2021年8月19日經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施,批號(hào):(2021)醫(yī)研倫審第(8-016)號(hào)。所有患者均簽署知情同意書。
利益沖突聲明:本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。
作者貢獻(xiàn)聲明:程齊齊負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析、文章撰寫;楊麗霞、蔡天盼、甘廈負(fù)責(zé)支持指導(dǎo)、修改論文;王亮、孫俊、梁佳圓、劉麗萍、阮寧杭負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)采集及分析;葛善飛負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì),擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。