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        羅非魚骨發(fā)酵制備膠原蛋白肽工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

        2022-12-27 02:04:46韋倩妮
        現(xiàn)代食品 2022年21期
        關(guān)鍵詞:下腳料魚骨羅非魚

        ◎ 韋倩妮

        (北海職業(yè)學(xué)院,廣西 北海 536000)

        我國羅非魚養(yǎng)殖量居世界前列,銷售和加工量大。在加工過程中,產(chǎn)生魚骨、魚片、魚鱗等大量下腳料,約占魚體的54%,其中魚頭、魚骨約占43%,占比最多[1]。我國水產(chǎn)品加工和副產(chǎn)物綜合利用的水平較低,若這些下腳料沒有得到有效利用,會造成資源浪費,甚至污染環(huán)境。隨著漁業(yè)的發(fā)展,魚類下腳料的高值化利用逐漸引起人們的重視,不少學(xué)者開展了研究。魚皮、魚頭、魚骨等部位常用于制備活化鈣,提取明膠、蛋白多肽和硫酸軟骨素等活性物質(zhì),也可制成即食魚排等各類休閑食品[2]。

        制備蛋白肽常用酶解法和發(fā)酵法,通過微生物發(fā)酵法提取多肽,可充分發(fā)揮微生物胞外酶對蛋白質(zhì)水解的作用,還可以利用其發(fā)酵過程產(chǎn)生的各種酶來分解脂肪和腥味物質(zhì)[3]。枯草芽孢桿菌是一種傳統(tǒng)食品用菌,具有良好的產(chǎn)酶能力。本文以羅非魚骨、魚頭制備魚骨漿原料,用枯草芽孢桿菌發(fā)酵,制備膠原蛋白肽。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        羅非魚,市售。枯草芽孢桿菌,北海職業(yè)學(xué)院食品檢驗檢測團隊選育;牛肉膏、蛋白胨,北京奧星生物技術(shù)有限公司;牛血清蛋白、福林酚酚試劑,北京索萊寶科技有限公司;酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅、氫氧化鈉、碳酸鈉和磷酸氫二鉀,廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心;三氯乙酸,福晨天津化學(xué)試劑有限公司。培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,調(diào)節(jié)pH 值至7.4~7.5,用于種子液制備。

        1.2 儀器與設(shè)備

        HWS-12 恒溫水浴鍋,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;250B 振蕩培養(yǎng)箱,金壇市宏華儀器廠;UV1000紫外分光光度計,上海翱藝儀器有限公司;TD-4Z 離心機,四川蜀科儀器有限公司;YXQ-LS-50S Ⅱ高壓滅菌鍋、SW-CJ-2FD 超凈工作臺,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 種子液的制備

        將枯草芽孢桿菌活化,接種于種子液培養(yǎng)基中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中,振蕩培養(yǎng)24 h。

        1.3.2 魚骨膠原蛋白肽水解液的制備

        羅非魚去鱗、去皮、去肉,清除內(nèi)臟,將魚體清洗干凈,魚頭、魚骨下腳料絞碎,得到魚骨漿。分別稱取一定質(zhì)量的魚骨漿和水于三角瓶中,用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min,得到發(fā)酵培養(yǎng)基。冷卻后,將枯草芽孢桿菌種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,置于一定溫度的培養(yǎng)箱,振蕩培養(yǎng)一定時間。將發(fā)酵液8 500 r·min-1離心10 min,收集上清,于98 ℃水浴5 min,滅酶,得到水解液。

        1.3.3 單因素試驗

        分別考察種子液接種量(3%、5%、7%、9%和11%)、發(fā)酵溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃)、魚骨漿添加量(8%、10%、12%、14%和16%)、發(fā)酵時間(18 h、24 h、30 h、36 h 和42 h)等4 個因素對水解度的影響。按照1.3.2 方法制備水解液,取上清,測定水解度。

        1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

        在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取接種量、發(fā)酵溫度、魚骨漿添加量3 個因素進行優(yōu)化,因素和水平見表1。

        表1 響應(yīng)面實驗因素水平表

        1.3.5 測定方法

        魚骨漿總蛋白的測定采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2016)。蛋白肽含量的測定采用福林-酚法測定,水解度采用TCA 法[4]。

        幼兒園一日活動始于晨間鍛煉,幼兒園的孩子非常活潑好動,對各種體育活動都有著濃厚的興趣,若是晨間鍛煉的體育活動沒有充分調(diào)動幼兒的積極性,使其參與到晨間鍛煉當(dāng)中,就會影響一日活動的整體效果。

        式中:N0為魚骨漿總蛋白的含量,g/100 g;N1為水解前可溶性多肽的含量,g/100 g;N2為水解后可溶性多肽的含量,g/100 g。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 接種量對水解度的影響

        由圖1可知,接種量為7%時,水解度最大。當(dāng)接種量較小時,菌量不足,發(fā)酵水平不高;隨著接種量增大,胞外酶分泌量增多,發(fā)酵周期短[3],但接種量過多,代謝廢物亦隨之增多,不利于發(fā)酵,導(dǎo)致水解度低[5]。

        圖1 不同接種量對水解度的影響圖

        2.2 發(fā)酵溫度對水解度的影響

        由圖2結(jié)果可知,溫度在35 ℃左右時,水解度最大。發(fā)酵溫度過高時,加劇了膠原蛋白肽鏈的斷裂,從而產(chǎn)生大量肽鏈片段[5]。

        圖2 不同發(fā)酵溫度對水解度的影響圖

        2.3 魚骨漿添加量對水解度的影響

        由圖3結(jié)果可知,當(dāng)魚骨漿添加量為12%時,水解度最大。當(dāng)魚骨漿添加量少時,培養(yǎng)基所含水分較多,枯草芽孢桿菌所產(chǎn)生的胞外酶被稀釋,影響酶的作用效果,降低水解效果[3]。

        圖3 魚骨漿添加量對水解度的影響圖

        2.4 發(fā)酵時間對水解度的影響

        由圖4結(jié)果可知,隨著發(fā)酵時間延長,水解度增大,當(dāng)發(fā)酵30 h 以后,水解度變化不大;發(fā)酵時間過長,發(fā)酵液會有異味。

        圖4 不同發(fā)酵時間對水解度的影響圖

        2.5 響應(yīng)面試驗優(yōu)化工藝條件

        2.5.1 回歸模型建立與方差分析

        在確定單個因素適宜的范圍后,選取接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)和魚骨漿添加量(C)為試驗因素,水解度(Y)為評價指標(biāo),用Design-Expert 11 進行Box-Benhken 試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析,結(jié)果見表2,顯著性檢驗和方差分析結(jié)果見表3。通過回歸分析,得到回歸方程Y=27.77+1.07A+1.04B+1.09C-0.367 5AB-0.482 5AC+1.32BC+1.32A2-1.60B2-0.948 5C。

        表2 羅非魚骨發(fā)酵制備膠原蛋白肽藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果表

        表3 回歸模型方差分析表

        由表3可知,此模型的P<0.01,說明此模型極顯著。失擬項P=0.380 9,大于0.05,失擬項不顯著,說明該模型的擬合程度比較好,與實際情況較吻合。同時模型的復(fù)決定系數(shù)R2=0.973 1,變異系數(shù)CV=1.87%,說明該模型的預(yù)測結(jié)果有較高的精密度及可靠性。由P值可知,除二次項C2、相互項AB、AC對水解度無顯著影響外,其他項A、B、C、A2、B2、BC對水解度有顯著影響。根據(jù)F值大小,水解度受各因素影響的順序為C(魚骨漿添加量)>A(接種量)>B(發(fā)酵溫度)。

        2.5.2 響應(yīng)面圖形分析與最佳工藝確定

        各個因素的交互作用響應(yīng)曲面圖如圖5所示。由圖5可知,當(dāng)接種量、發(fā)酵溫度、魚骨漿添加量取值較小時,效應(yīng)曲面較陡,對水解度影響比較顯著。各交互作用中,接種量(A)與發(fā)酵溫度(B),接種量(A)與魚骨漿添加量(C)的等高線接近圓形,交互作用不顯著,發(fā)酵溫度(B)與魚骨漿添加量(C)的等高線為橢圓,交互作用顯著。通過軟件分析,得到水解的最佳工藝條件為接種量7.80%、發(fā)酵溫度36.59 ℃、魚骨漿添加量13.28%,在此條件下水解度的預(yù)測值為28.57%。為驗證響應(yīng)面試驗預(yù)測結(jié)果的可靠性,并結(jié)合實際生產(chǎn)需要,將最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為接種量7.8%、發(fā)酵溫度36.6 ℃、魚骨漿添加量13.3%,發(fā)酵時間30 h。按優(yōu)化的條件進行3 次重復(fù)試驗,水解度的平均值為28.52%,與模型的預(yù)測值接近,說明本試驗優(yōu)化的方法可行。

        圖5 接種量、發(fā)酵溫度、魚骨漿添加量交互作用對水解度影響的響應(yīng)面圖

        3 結(jié)論

        羅非魚加工中產(chǎn)生的魚骨、魚頭等下腳料占比較大,如果僅作用于生產(chǎn)傳統(tǒng)飼料,利用價值較低。本研究以魚骨漿為原料、水解度為評價指標(biāo),通過單因素試驗篩選,用響應(yīng)面試驗優(yōu)化水解的工藝條件,結(jié)果為接種量7.8%、發(fā)酵溫度36.6 ℃、魚骨漿添加量13.3%,發(fā)酵時間30 h。在此條件下,水解度可達28.52%。本試驗為水產(chǎn)品加工下腳料的高值化利用提供了參考,具有應(yīng)用價值。

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