易建華， 胡駿鵬， 覃先武， 戴晉軍，王 輝， 宋慶洋， 王 欽*

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；2.湖北省酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443003）

光合細(xì)菌（PSB）是具有原始光能合成體系的原核生物的總稱，其廣泛存在于水田、湖泊、江河、海洋、活性污泥及土壤內(nèi)，是一類以光作為能源，在厭氧光照或好氧黑暗條件下，利用有機(jī)物、硫化物、氨等作為供氫體兼碳源進(jìn)行光合作用的微生物（Lami等，2007；Kelley等，1978）。光合細(xì)菌體內(nèi)富含生物素、蛋白質(zhì)、多種維生素、輔酶Q、類胡蘿卜素等生理活性物質(zhì)（Wang等，2017），廣泛用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，可以促進(jìn)動植物生長，增強(qiáng)抗病機(jī)能，減少疾病發(fā)生，提高生物存活率（Su等，2017；曹琛，2010；肖永清，2002）。光合細(xì)菌通過光合作用將廢棄有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為自身所需營養(yǎng)，能夠凈化水質(zhì)和改善環(huán)境。研究表明，光合細(xì)菌在醫(yī)藥、食品、制氫等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景（郭慶華和戴奕杰，2018；王飛等，2010；Basak等，2007）。

由于光合細(xì)菌菌體體積小、培養(yǎng)液密度低，導(dǎo)致菌體回收難，極大地限制了光合細(xì)菌的市場發(fā)展（Hülsen，2018；何劍丹，2005）。與傳統(tǒng)的離心技術(shù)相比，絮凝技術(shù)作為一種相對耗能少、成本低、操作簡單的適合于大規(guī)模采收的技術(shù)，正逐漸受到研究者的關(guān)注（Fasaei等，2018；張同遷，2018）。何丹等（2020）使用1900 mg/L氯化鐵絮凝光合細(xì)菌菌液靜置10 min，絮凝回收率達(dá)到最大，為（99.99±0.01）%；使用1500 mg/L硫酸鋁絮凝光合細(xì)菌菌液靜置10 min，絮凝回收率達(dá)到最大，為（98.24±0.01）%。黃業(yè)翔等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，使用聚合氯化鋁質(zhì)量濃度為1800 mg/L絮凝光合細(xì)菌時接近70%光合細(xì)菌絮凝沉淀。張秀霞等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，酵母對光合細(xì)菌有一定絮凝沉降效果。何丹等（2020）使用0.008 g/L殼聚糖絮凝光合細(xì)菌，絮凝回收率達(dá)到（84.20±0.02）%。本研究比較5種絮凝劑對光合細(xì)菌的絮凝效果，確定適宜的絮凝劑及其適宜濃度與絮凝時間。通過絮凝沉降試驗(yàn)，探討不同絮凝劑的沉降效果，旨在篩選安全、高效、低成本的絮凝劑，為光合細(xì)菌的采收工藝研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑 配養(yǎng)基：乙酸鈉3.0 g/L、硫酸銨1.0 g/L、氯化鈉1.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、氯化鈣0.05 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、酵母膏0.1 g/L和微量元素。所用菌種購自廣東微生物菌種保藏中心的莢膜紅細(xì)菌Rhodobacter capsulatus（保藏號：GDMCC 1.168）。光合細(xì)菌所用培備液1 mL。其中微量元素貯備液的基本成分：乙二胺四乙酸二鈉2 g/L、硫酸亞鐵0.2 g/L、氯化錳0.1 g/L、硼酸0.1 g/L、氯化鈷0.1 g/L、氯化鋅0.1 g/L、硫酸銅0.1 g/L。絮凝劑：硫酸鋁、聚合氯化鋁、硫酸亞鐵、氯化鐵，上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn)。所有試劑均為分析純；酵母細(xì)胞壁（改性型）由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備 實(shí)驗(yàn)室pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)；精密電子天平，賽多利科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；HYL-A全溫?fù)u瓶柜，太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司生產(chǎn)；SWCJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；78HW-1數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，杭州儀表電機(jī)有限公司生產(chǎn)。

1.3 光合細(xì)菌培養(yǎng) 光合細(xì)菌培養(yǎng)基121℃，滅菌15 min，按20%接種量接種光合細(xì)菌菌液，于30℃、光強(qiáng)2500 Lux的智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96 h，測OD660nm值為0.8～1.0，備用。

1.4 絮凝劑沉降試驗(yàn) 通過試驗(yàn)測定了無機(jī)硫酸鋁、聚合氯化鋁、硫酸亞鐵、氯化鐵及酵母細(xì)胞壁5種絮凝劑對光合細(xì)菌的絮凝效果。絮凝劑加入在100 mL PSB菌液充分混勻，絮凝劑濃度為500、1000、1500、2000 mg/L的無機(jī)硫酸鋁，或聚合氯化鋁，或硫酸亞鐵，或氯化鐵，或酵母細(xì)胞壁。在不同靜置時間測定OD660值，計算絮凝率。每個試驗(yàn)平行測定3次。

絮凝率Y/%=（OD0混合均勻菌液OD660-ODt上清液OD660）/OD0混合均勻菌液OD660×100。

式中：Y為絮凝率；OD0為原始菌液OD值；ODt為靜置t時間的OD值。

1.5 數(shù)據(jù)處理 各組數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，統(tǒng)計分析采用鄧肯式多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化鐵質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌絮凝回收率的影響 由圖1可知，光合細(xì)菌菌液中添加聚合氯化鋁后，菌液迅速形成絮狀物并開始分層，絮狀物快速聚集沉降，隨著氯化鐵濃度的增加，上清液顏色越來越淡，沉降菌液體積越來越大。對單一質(zhì)量濃度而言，在靜置1 h左右時絮凝效果趨于穩(wěn)定，此后回收率幾乎不再發(fā)生變化。氯化鐵的質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌的回收率有顯著影響（P＜0.05）。隨氯化鐵質(zhì)量濃度升高，回收率先升高后趨于穩(wěn)定。當(dāng)氯化鐵質(zhì)量濃度為500 mg/L時，回收率最低，為（83.61±0.64）%；隨著氯化鐵質(zhì)量濃度的增加，光合細(xì)菌回收率逐漸增加；當(dāng)氯化鐵質(zhì)量濃度為1000 mg/L時達(dá)到最高回收率，為（98.10±0.24）%。因此，以氯化鐵為絮凝劑時，質(zhì)量濃度為1000 mg/L時最佳。

圖1 氯化鐵質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌絮凝率的影響

2.2 硫酸鋁質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌絮凝回收率的影響 由圖2可知，光合細(xì)菌菌液中加入硫酸鋁，迅速形成較大塊的絮凝物，絮凝物或沉于底部或懸浮于液體中。對單一質(zhì)量濃度而言，在靜置時間1 h時趨于絮凝效果穩(wěn)定，此后回收率幾乎不再發(fā)生變化。硫酸鋁質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌的回收率有顯著影響（P＜0.05）。硫酸鋁質(zhì)量濃度越大，回收率先增大后減小。當(dāng)硫酸鋁質(zhì)量濃度為500 mg/L時，回收率僅為（81.88±0.81）%；硫酸鋁質(zhì)量濃度為1000 mg/L時達(dá)最高回收率，增加到（94.12±0.13）%；繼續(xù)增加硫酸鋁的質(zhì)量濃度1500～2000 mg/L，光合細(xì)菌的回收率顯著降低85.62%～66.42%。因此以硫酸鋁為絮凝劑時，質(zhì)量濃度為1000 mg/L時最佳。

圖2 硫酸鋁質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌絮凝率的影響

2.3 硫酸亞鐵質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌絮凝回收率的影響 由圖3可知，光合細(xì)菌菌液中加入硫酸亞鐵后形成絮狀物，有一些小絮狀物懸浮于菌液中但不沉降。對單一質(zhì)量濃度而言，在靜置時間1 h時趨于絮凝效果穩(wěn)定，此后回收率幾乎不再發(fā)生變化。硫酸亞鐵的質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌的回收率有顯著影響（P＜0.05）。隨硫酸亞鐵質(zhì)量濃度升高，回收率先升高后趨于穩(wěn)定。當(dāng)硫酸亞鐵質(zhì)量濃度為500 mg/L時，回收率最低，為（80.19±0.13）%；隨著硫酸亞鐵質(zhì)量濃度的增加，光合細(xì)菌回收率逐漸增加；當(dāng)硫酸亞鐵質(zhì)量濃度為1500 mg/L時達(dá)到最高回收率，為（90.56±0.16）%。因此以硫酸亞鐵為絮凝劑時，質(zhì)量濃度為1500 mg/L時最佳。

圖3 硫酸亞鐵質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌絮凝率的影響

2.4 酵母細(xì)胞壁質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌絮凝回收率的影響 由圖4可知，光合細(xì)菌菌液中添加酵母后，菌液形成絮狀物并開始分層，絮狀物聚集沉降，隨著酵母細(xì)胞壁濃度的增加，上清液顏色越來越淡，沉降菌液體積越來越大。對單一質(zhì)量濃度而言，在靜置時間1 h時趨于絮凝效果穩(wěn)定，此后回收率幾乎不再發(fā)生變化。酵母細(xì)胞壁的質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌的回收率有顯著影響（P＜0.05）。酵母細(xì)胞壁質(zhì)量濃度越大回收率越高。當(dāng)酵母細(xì)胞壁質(zhì)量濃度為20 mg/L時，回收率最低，為（20.68±0.34）%；隨著酵母細(xì)胞壁質(zhì)量濃度的增加，光合細(xì)菌回收率逐漸增加；當(dāng)酵母細(xì)胞壁質(zhì)量濃度為80 mg/L時達(dá)到最高回收率，為（77.65±0.33）%。因此以酵母細(xì)胞壁為絮凝劑時，質(zhì)量濃度為80 mg/L時最佳。

圖4 酵母細(xì)胞壁質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌絮凝率的影響

2.5 聚合氯化鋁質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌絮凝回收率的影響 由圖5可知，光合細(xì)菌菌液中添加聚合氯化鋁后，菌液迅速形成絮狀物并開始分層，絮狀物快速聚集沉降，隨著聚合氯化鋁濃度的增加，上清液顏色越來越淡，沉降菌液體積越來越大。對單一質(zhì)量濃度而言，在靜置時間1 h時趨于絮凝效果穩(wěn)定，此后回收率幾乎不再發(fā)生變化。聚合氯化鋁的質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌的回收率有顯著影響（P＜0.05）。聚合氯化鋁質(zhì)量濃度越大回收率越高。當(dāng)聚合氯化鋁質(zhì)量濃度為500 mg/L時，回收率最低，為（42.41±0.45）%；隨著聚合氯化鋁質(zhì)量濃度的增加，光合細(xì)菌回收率逐漸增加；當(dāng)聚合氯化鋁質(zhì)量濃度為2000 mg/L時達(dá)到最高回收率，為（70.83±0.44）%。因此以聚合氯化鋁為絮凝劑時，質(zhì)量濃度為2000 mg/L時最佳。

圖5 聚合氯化鋁質(zhì)量濃度對光合細(xì)菌絮凝率的影響

3 討論

光合細(xì)菌常規(guī)條件下自然沉降困難，導(dǎo)致固液分離困難，影響菌體資源回收。目前，光合細(xì)菌采收工藝主要是高速離心和絮凝沉淀（Fasaei等，2018；梁志華和王夢亮，2010）。Fasaei等（2018）研究表明，絮凝技術(shù)相對耗能少、成本低、操作簡單，適于大規(guī)模采收。因此，本試驗(yàn)采用了相對較好的絮凝技術(shù)進(jìn)行光合細(xì)菌采收。

無機(jī)絮凝劑會在水中發(fā)生水解反應(yīng)生成中間產(chǎn)物，水中的光合細(xì)菌細(xì)胞在中間產(chǎn)物的作用下進(jìn)行吸附電中和、吸附架橋或吸附卷掃等作用，通過這些相互作用生成粗大的絮凝體，從而沉降下來（田玲等，2004）。該試驗(yàn)中，氯化鐵、氯化亞鐵、硫酸鋁和聚合氯化鋁加入光合細(xì)菌菌液后，在水中與光合細(xì)菌菌體所帶的負(fù)電荷瞬間產(chǎn)生中和作用而迅速絮凝，并進(jìn)一步架橋生成大絮團(tuán)而快速沉降。使用無機(jī)和有機(jī)絮凝劑，首先是用量大，其次還需要對殘留物及其副產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步無毒無害化處理，導(dǎo)致其在生產(chǎn)生活中的應(yīng)用受到了限制。因此，對絮凝劑的研究轉(zhuǎn)變成向著無毒害化方向發(fā)展。由于生物絮凝劑可以克服無機(jī)和有機(jī)絮凝劑本身的缺陷，零排放，對環(huán)境幾乎不存在污染現(xiàn)象，因此，生物絮凝劑成為研究的熱點(diǎn)（封培等，2009）。酵母細(xì)胞壁是從酵母的細(xì)胞壁中提取出來的一些大分子糖類聚合物，內(nèi)層為葡聚糖層，中間層主要由蛋白質(zhì)組成，外層為甘露聚糖層，這種特殊的結(jié)構(gòu)促進(jìn)絮凝劑快速形成穩(wěn)定的絮體從而絮凝光合細(xì)菌。

試驗(yàn)研究表明，硫酸鋁、聚合氯化鋁、硫酸亞鐵、氯化鐵及酵母細(xì)胞壁5種絮凝劑對光合細(xì)菌均有較好的絮凝效果。氯化鐵添加量為1000 mg/L時，1 h的絮凝率即可達(dá)到（98.10±0.24）%。該結(jié)果與何丹等（2020）研究結(jié)果相類似。氯化鐵對光合細(xì)菌絮凝效果顯著高于硫酸鋁。陳亞松（2011）研究表明，鐵系絮凝劑較鋁系絮凝劑對光合細(xì)菌等微生物的抑制作用小，更適合用來絮凝光合細(xì)菌等微生物。同屬鐵系絮凝劑硫酸亞鐵的絮凝采收能力卻不及氯化鐵，由于氯化鐵中鐵離子在水中會生成氫氧化鐵膠體來絮凝光合細(xì)菌，硫酸亞鐵中亞鐵離子氧化生成鐵離子，進(jìn)而水解成氫氧化鐵膠體達(dá)到絮凝光合細(xì)菌（嚴(yán)言正，1986）。聚合氯化鋁的絮凝效果較其他4種絮凝劑絮凝效果表現(xiàn)不佳，當(dāng)聚合氯化鋁質(zhì)量濃度為2000 mg/L時達(dá)到最高回收率，僅為（70.83±0.44）%，這與黃業(yè)翔等（2018）的研究結(jié)果相類似。張秀霞（2020）研究了不同絮凝劑聚合氯化鋁、聚丙烯酰胺陽離子型和陰離子型、酵母對沼澤紅假單胞菌絮凝效果，結(jié)果表明2000 mg/L聚合氯化鋁的光合細(xì)菌絮凝采收率可以達(dá)到（96.86±0.01）%；閆海等（2015）研究了不同鋁鹽如硫酸鋁、明礬、氯化鋁和聚合氯化鋁采收沼澤紅假單胞菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.01 mol/L聚合氯化鋁幾乎能夠絮凝培養(yǎng)液中全部的光合細(xì)菌細(xì)胞。與其他絮凝劑相比，酵母細(xì)胞壁的質(zhì)量濃度為80 mg/L時回收率最高，可達(dá)（77.65±0.33）%。酵母細(xì)胞壁不僅市場價格相比于硫酸鋁、聚合氯化鋁、硫酸亞鐵、氯化鐵較低，而且不像鋁鹽和鐵鹽對生物有害，絮凝得到的菌體之間結(jié)合更緊密，更利于菌水分離。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸鋁、聚合氯化鋁、硫酸亞鐵、氯化鐵及酵母細(xì)胞壁5種絮凝劑均能高效回收光合細(xì)菌，其中酵母細(xì)胞壁更適于用來絮凝光合細(xì)菌，且適宜的質(zhì)量濃度為80 mg/L，時間為1 h。