侯粲，肖杰，王黎明，王曦，范怡航，倪志堅，牛興和，唐培安，應(yīng)劍*

1(中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京，102209)2(營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京，102209)3(寧波曉寬生物科技有限公司，浙江 寧波，315100)4(南京財經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京，210023)

便秘是臨床常見的消化道癥狀，主要表現(xiàn)為排便減少(3 次/周)、大便干硬、排便困難[1]，《國際疾病分類(ICD-10)應(yīng)用指導(dǎo)手冊》將便秘列為獨(dú)立病種[2]。根據(jù)便秘的形成原因，可分為先天性便秘、特發(fā)性便秘和繼發(fā)性便秘。特發(fā)性便秘，又稱功能性便秘(functional constipation，F(xiàn)C)，是一種不屬于器質(zhì)性病變的便秘。功能性便秘的藥物治療常用膨松劑、滲透瀉藥、糞便軟化劑等[3]。然而，不同患者對藥物治療的滿意度不同，副作用也給藥物治療帶來了新的麻煩[4-5]。因此，改善便秘的特殊飲食越來越受歡迎[6]。

發(fā)酵在很早以前就被用于人類消費(fèi)和食品生產(chǎn)，發(fā)酵過程不僅有利于延長食品、飲料的保質(zhì)期，而且可以安全有效地提高營養(yǎng)價值[7]。發(fā)酵食品食用相對方便，營養(yǎng)成分豐富，多數(shù)脂肪含量低，風(fēng)味、香氣和質(zhì)地多樣[8]。正是由于發(fā)酵技術(shù)及其相關(guān)的傳統(tǒng)食品的產(chǎn)生，使得果蔬產(chǎn)品的高蛋白膳食成分被應(yīng)用，這些食品提供了豐富的、高質(zhì)量營養(yǎng)素，且易被接受。發(fā)酵蔬果產(chǎn)品富含人體所需的微生物代謝物(如乳酸和氨基酸)，提高膳食營養(yǎng)價值。發(fā)酵還可以幫助去除或轉(zhuǎn)化食物中的有毒成分，如植物中的植酸[9-10]。針對發(fā)酵食品的健康功效研究，包括抗便秘、抗肥胖、抗癌、促進(jìn)結(jié)直腸健康、降低膽固醇、抗氧化、抗衰老、促進(jìn)纖維分解以及促進(jìn)免疫和皮膚健康[11-14]。近年來，食品和營養(yǎng)科學(xué)家開始提供更有力的證據(jù)，證明食用發(fā)酵產(chǎn)品對幾種慢性疾病可能產(chǎn)生積極影響[15]。這些好處都?xì)w功于微生物本身和它們在食物中產(chǎn)生的代謝物。此外，人類微生物群對宿主健康的重要性以及它們之間主要通過腸道微生物相互作用的方式也得到了闡明[16]，其化學(xué)成分和微生物代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)腸道菌群和增強(qiáng)免疫力方面起著重要作用。發(fā)酵果蔬汁的通便作用已有報道[17-18]，其作用機(jī)制歸因于2個方面：一是發(fā)酵果蔬汁富含膳食纖維，水不溶性膳食纖維具有較強(qiáng)的持水力，使糞便柔軟易于排出；二是水溶性膳食纖維易被腸道菌群酵解，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，降低腸內(nèi)pH值，同時與酵解產(chǎn)物甲烷、CO2等氣體共同刺激腸黏膜、促進(jìn)腸道蠕動[19]。但對于發(fā)酵果蔬汁干預(yù)對腸道菌群的影響研究較少，WANG等[20]研究指出正常小鼠干預(yù)發(fā)酵果蔬汁后的腸道菌群變化，厚壁菌門與擬桿菌門的相對豐度比例降低，Prevotellaceae、Bacteroidales_S24-7_group、Bacteroidaceae和Bacteroides等菌的相對豐度出現(xiàn)上升趨勢。針對發(fā)酵果蔬汁干預(yù)便秘小鼠后腸道菌群的變化情況尚無研究報道。

以無花果為主要原料，通過特定的發(fā)酵工藝生產(chǎn)出果蔬汁，對其提高免疫力和清除自由基的作用已有研究，但以便秘小鼠為模型，考察其對于小鼠腸道微生物群的影響未見報告。因此，本研究在建立功能性便秘的實(shí)驗(yàn)動物模型的基礎(chǔ)上，探索發(fā)酵果蔬汁的通便作用，解讀其對于腸道菌群的影響，為開發(fā)利用發(fā)酵果蔬汁產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品，以無花果為主要原料，通過特定的發(fā)酵工藝生產(chǎn)出果蔬汁，寧波曉寬生物科技有限公司；蒽酮、硫酸、MgCl2、無水乙醇、AlCl3·6H2O、乙酸鉀、維生素C穩(wěn)定液(10 mg/mL)、福林酚試劑、Na2CO3,均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈,均為色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DNA分離提取(MOBIO PowerSoil DNA Isolation)試劑盒，深圳市安必勝科技有限公司，微生物16S基因靶向測序由深圳譜元科技有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q Integral5水處理系統(tǒng)，默克密理博有限公司；Allegra25R離心機(jī)，貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司；Thermo Scientific 2842水浴鍋、超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道阱質(zhì)譜儀(ultra-high performance liquid chromatography quadrupole Orbitrap mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive)、Xcalibur工作站，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高分辨質(zhì)譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法分析發(fā)酵果蔬汁樣品成分

精密量取發(fā)酵果蔬汁樣品2 mL至250 mL容量瓶，加去離子水稀釋100倍，混合均勻后靜置10 min，取10 mL樣品經(jīng)3 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，待測。

色譜條件：固定相為Thermo Fisher Accucore Vanquish-C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱，流動相A為乙腈溶液，流動相B為0.3%(體積分?jǐn)?shù))乙酸水溶液，梯度洗脫，條件如下：0～45 min，4%～40%乙腈；45～55 min，40%～95%乙腈；55～60 min，95%～4%乙腈，流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：UPLC-Q-Exactive質(zhì)譜儀，鞘氣流速50 arb，輔助氣流速15 arb，噴霧電壓3 500 V，離子傳輸毛細(xì)管溫度320 ℃，輔助氣加熱溫度300 ℃，全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500 u。離子響應(yīng)大于100 cps進(jìn)行二級質(zhì)譜信息采集：碰撞能量40 V，開啟動態(tài)背景扣除。

1.3.2 動物通便實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

實(shí)驗(yàn)動物選擇：BALB/c成年雄性小鼠，體重(20±2) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于SPF級動物房。

SPF級動物房：室溫(22±2) ℃，相對濕度40%～70%，12 h人工照明/黑暗循環(huán)，換氣次數(shù)15 次/h。小鼠自由攝食并飲水，適應(yīng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組：雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，設(shè)置空白對照組(BC組)、模型對照組(MC組)、低劑量干預(yù)組(5 mL/kg BW，LI組)、中劑量干預(yù)組(10 mL/kg BW，MI組)、高劑量干預(yù)組(20 mL/kg BW，HI組)3個劑量組。

1.3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法及指標(biāo)測定

連續(xù)經(jīng)口給予發(fā)酵果蔬汁樣品及蒸餾水7 d，各組小鼠禁食16 h，MC組和各干預(yù)組小鼠灌胃給予復(fù)方地芬諾酯(5 mg/kg BW)，灌胃量為0.4 mL/(20 g BW)，BC組小鼠灌胃給予等量蒸餾水。灌胃復(fù)方地芬諾酯及給予蒸餾水0.5 h后，各干預(yù)組分別灌胃含相應(yīng)樣品的墨汁，灌胃量為0.4 mL/(20 g BW)，BC組和MC組小鼠灌胃等量墨汁，正常飲水禁食，從灌墨汁開始，觀察記錄每只小鼠首粒排出黑便時間、6 h內(nèi)小鼠排黑便粒數(shù)。

1.3.3 腸道菌群測定

實(shí)驗(yàn)過程中，各組小鼠單籠飼養(yǎng)，在給予受試樣本前，無菌采取小鼠糞便0.1 g、最后一次給予受試樣品后24 h，與實(shí)驗(yàn)前同樣方式取直腸糞便，均存于取樣管中(內(nèi)含裂解液和穩(wěn)定液)，由深圳譜元科技有限公司完成腸道微生物16S基因靶向測序分析[21]。具體方法為：使用細(xì)菌DNA提取試劑盒(DP302)提取小鼠腸道內(nèi)容物的細(xì)菌基因組，經(jīng)NanoDrop2000測定選擇DNA質(zhì)量濃度為20 ng/μL的樣本進(jìn)行下一步PCR擴(kuò)增?；蚪M通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，得到細(xì)菌16S rRNA基因的V4～V5區(qū)。擴(kuò)增子經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠回收提取，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒，按照說明進(jìn)行純化，采用QuantiFluorTM-ST (Promega，U.S.)進(jìn)行定量。純化后的擴(kuò)增子匯集在等分子質(zhì)量的測序池中，使用Illumina MiSeq進(jìn)行配對測序(2×PE300)。原始fastq文件使用QIIME(1.17版)進(jìn)行質(zhì)量過濾。具有97%相似性的序列通過UPARSE(版本7.1 http://drive5.com/uparse/)聚類為一個操作單元(operational taxonomic unit，OTU)，并使用UCHIME識別和去除嵌合體序列。使用RDP分類器(http://rdp.cme.msu.edu/)對置信閾值為70%的silva (SSU115)16S rRNA數(shù)據(jù)庫中每個16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育親緣關(guān)系進(jìn)行分析及注釋。

1.4 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜數(shù)據(jù)：UPLC-Q-Exactive質(zhì)譜儀采集數(shù)據(jù)后導(dǎo)入Compounds Discovery軟件，噪音過濾、自動排除無用峰等，對數(shù)據(jù)降維。其中質(zhì)譜數(shù)據(jù)穩(wěn)定性和可靠性由質(zhì)量控制樣本控制。

譜庫篩查：利用Compounds Discovery軟件，同時參照化合物的同位素分布和精確質(zhì)量數(shù)匹配信息，結(jié)合化合物的二級質(zhì)譜信息，利用mzVault(含1 200多種植物化合物標(biāo)準(zhǔn)品一級、二級碎片質(zhì)譜圖信息、mzCloud(化合物高精確質(zhì)量數(shù)碎片數(shù)據(jù)庫)、ChemSpider等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行化合物譜庫匹配。

所有數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 20.0進(jìn)行ANOVA分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01、P<0.001為差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵果蔬汁成分分析結(jié)果

通過快速質(zhì)譜分析和化學(xué)計量學(xué)方法，對發(fā)酵果蔬汁中可能含有的活性成分進(jìn)行預(yù)測。化合物匹配結(jié)果(匹配分?jǐn)?shù)均大于85分)，見表1。發(fā)酵果蔬汁含有豐富的黃酮類化合物、酚類(酚酸類)、較高的超氧化物歧化酶活性，同時存在較多的有機(jī)酸、氨酸酯類物質(zhì)、糖類物質(zhì)。這與前人研究結(jié)果一致[22-23]，歸因于發(fā)酵果蔬汁的原料特性。酚類化合物大多數(shù)能夠到達(dá)結(jié)腸，被微生物利用產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，次級代謝產(chǎn)物被機(jī)體吸收，從而產(chǎn)生生理效應(yīng)。發(fā)酵過程中，糖基化酚化合物在水解酶作用下，脫去糖基轉(zhuǎn)化為酚類化合物、簡單黃酮醇化合物等，游離酚類化合物更易發(fā)揮抗氧化作用。

表1 發(fā)酵果蔬汁成分匹配結(jié)果Table 1 The component of fermented fermented fruit and vegetable juice

2.2 小鼠通便實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)小鼠給予不同濃度發(fā)酵果蔬汁14 d后，各組小鼠的狀態(tài)均未有明顯改變，精神狀態(tài)良好，毛色及行動正常，體重沒有顯著差異。與BC組小鼠相比，各劑量組小鼠糞粒正常，為褐黃色麥粒狀，各組小鼠沒有腹瀉現(xiàn)象。

由圖1可以看出，與MC組相比，MI組可以顯著縮短首粒黑便時間，由MC組的(111±19) min縮短為(92±15) min。6 h黑便粒數(shù)在LI、MI、HI組中分別為(20.83±5.98)、(21.82±5.89)和(27.70±5.11)，呈明顯劑量依賴性，且均高于MC組(19.17±2.52)。以上結(jié)果說明，發(fā)酵果蔬汁干預(yù)有助于促進(jìn)小鼠腸道蠕動和提高排便量。一方面，發(fā)酵果蔬汁中的脂肪類有機(jī)酸(琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸等)對墨汁在小鼠小腸的運(yùn)動有明顯的促進(jìn)作用[24]；另一方面由水不溶性膳食纖維和水溶性膳食纖維共同作用，對糞便本身的含水量、體積等產(chǎn)生影響，同時對腸道微環(huán)境產(chǎn)生影響[18]，從而發(fā)揮輔助通便的作用。

a-首粒黑便排出時間；b-6 h排出黑便粒數(shù)圖1 各組小鼠首粒黑便排出時間和6 h排出黑便粒數(shù)Fig.1 The time of the first black feces excretion and the number of black feces excretion in 6 h注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(下同)

2.3 發(fā)酵果蔬汁干預(yù)對小鼠腸道菌群的影響

采用干預(yù)后的腸道菌群豐度數(shù)據(jù)分析腸道菌群α-多樣性及門屬水平變化情況，多樣性分析包含豐富度(Obeserved_OTUs，反映樣品中含有的物種數(shù)目，數(shù)值越高表明樣品物種豐富度越高)和均勻度(Shannon 指數(shù)，評估樣本中物種組成的豐富度和均勻度，值越大表示該環(huán)境的物種越豐富，各物種分配越均勻)。

由圖2可知，干預(yù)后小鼠腸道菌群Obeserved_OTUs值與Shannon指數(shù)值均產(chǎn)生變化，說明干預(yù)后，小鼠腸道菌群的豐富度及均勻度產(chǎn)生了變化。與MC組相比，MI、HI組的Obeserved_OTUs值、Shannon 指數(shù)值出現(xiàn)下降趨勢，差異顯著(P<0.05)，說明發(fā)酵果蔬汁干預(yù)對腸道菌群物種豐富度和均勻度有影響。發(fā)酵果蔬汁中的脂肪族有機(jī)酸能夠降低腸道內(nèi)pH值，具有重要的腸道調(diào)節(jié)功能[25]，且高劑量干預(yù)下，腸道菌群多樣性變化較大，提示發(fā)酵果蔬汁干預(yù)劑量不宜過高，易破壞腸道整體微生態(tài)平衡。因此推薦劑量為中劑量，即人每次飲用發(fā)酵果蔬汁原液30 mL，每日2次。

a-Obeserved_OTUs；b-Shannon指數(shù)圖2 發(fā)酵果蔬汁干預(yù)對小鼠腸道菌群α-多樣性的影響Fig.2 Effect of fermented fruit and vegetable juice on α-diversity

對MI組屬水平腸道微生物進(jìn)行wilcox秩和檢驗(yàn)及fold change分析，結(jié)果見圖3。經(jīng)發(fā)酵果蔬汁干預(yù)后，MI組小鼠體內(nèi)厭氧棒狀菌屬(Anaerostipes)、對腸道具有保護(hù)作用的分節(jié)絲狀菌屬(CandidatusArthromitus)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)等菌的相對豐度升高。與認(rèn)知能力負(fù)相關(guān)的Mucispirillum屬[26]、擬桿菌屬(Bacteroides)、顫螺菌屬(Oscillospira)、理研菌科(Rikenellaceae)、與腸炎相關(guān)的嗜膽菌屬(Bilophila)等相對豐度降低。提示發(fā)酵果蔬汁干預(yù)后，腸道菌群從肉食型向植食型轉(zhuǎn)變，對腸道具有保護(hù)作用的菌屬相對豐度增加，而與腸道炎癥等相關(guān)的菌屬相對豐度減少。

a-中劑量干預(yù)組wilcox秩和檢驗(yàn);b-fold change分析圖3 中劑量干預(yù)組wilcox秩和檢驗(yàn)及fold change分析結(jié)果Fig.3 Results of wilcox test and fold change analysis in the medium dose intervention group

3 結(jié)論

基于超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道阱質(zhì)譜系統(tǒng)，分析發(fā)酵型果蔬汁的物質(zhì)組成規(guī)律。通過數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定出32種化合物，包括黃酮類、氨基酸類、有機(jī)酸類、糖類等物質(zhì)。

動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，中劑量干預(yù)組可以顯著縮短首粒黑便時間，6 h黑便粒數(shù)低、中、高劑量干預(yù)組分別為(20.83±5.98)、(21.82±5.89)和(27.70±5.11)，排便量呈明顯劑量依賴性。腸道菌群結(jié)果顯示，發(fā)酵果蔬汁干預(yù)后，小鼠腸道菌群的豐富度及均勻度產(chǎn)生了變化。高劑量發(fā)酵果蔬汁干預(yù)下，腸道菌群多樣性變化較大，提示發(fā)酵果蔬汁干預(yù)劑量不宜過高，易破壞腸道整體微生態(tài)平衡。因此推薦劑量為中劑量，即人每次飲用發(fā)酵果蔬汁原液30 mL，每日2次。中劑量干預(yù)組小鼠經(jīng)發(fā)酵果蔬汁干預(yù)后，厭氧棒狀菌屬(Anaerostipes)、對腸道具有保護(hù)作用的分節(jié)絲狀菌屬(CandidatusArthromitus)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)等菌的相對豐度升高，與認(rèn)知能力負(fù)相關(guān)的Mucispirillum菌屬、擬桿菌屬(Bacteroides)、顫螺菌屬(Oscillospira)、理研菌科(Rikenellaceae)、與腸炎相關(guān)的嗜膽菌屬(Bilophila)等菌的相對豐度降低，表明發(fā)酵果蔬汁干預(yù)后，腸道菌群從肉食型向植食型轉(zhuǎn)變，對腸道有保護(hù)作用的菌屬相對豐度增加，而與腸道炎癥等相關(guān)的菌屬相對豐度減少。

發(fā)酵果蔬汁具有促進(jìn)小鼠腸道蠕動和提高排便量的作用，同時能夠改善腸道微生態(tài)，為產(chǎn)品的功效作用提供數(shù)據(jù)支持。對于發(fā)揮通便作用的關(guān)鍵化合物及其作用機(jī)制，應(yīng)通過系列研究進(jìn)一步論證分析。