全曉靜 常丹燕 許曉毓 戴菲 王進(jìn)海

慢性便秘是糖尿病常見(jiàn)并發(fā)癥之一[1]，但發(fā)生機(jī)制尚未完全明確。目前研究認(rèn)為，糖尿病相關(guān)便秘的病理生理機(jī)制包括腸道間質(zhì)Cajal細(xì)胞減少、腸神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等[2]。硫化氫(H2S)是一種氣體信號(hào)分子，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)可通過(guò)胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)催化底物L(fēng)-半胱氨酸生成[3]。H2S在消化道動(dòng)力調(diào)控中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，低濃度時(shí)具有促進(jìn)作用,而高濃度時(shí)具有抑制作用[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，H2S在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠胰腺、肝臟等組織器官中水平明顯增加，說(shuō)明H2S可能參與糖尿病不同組織器官功能障礙的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究采用STZ誘導(dǎo)建立雄性C57BL/6糖尿病模型小鼠，觀察其結(jié)腸動(dòng)力變化及CES和CBS的表達(dá)水平以明確其在糖尿病模型小鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙中的作用及機(jī)制。

材料與方法

1.材料：SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠(8周齡)購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：63241547)。小鼠飼養(yǎng)溫度(24±1) ℃，濕度65%～66%，自由飲食。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021866)。實(shí)驗(yàn)溶液包括臺(tái)式液、無(wú)鈣生理鹽水溶液(PSS)、L型鈣離子通道電極內(nèi)液和細(xì)胞消化液，其配方與前期研究一致[8]。實(shí)驗(yàn)試劑：STZ、H2S供體硫氫化鈉(NaHS)、河豚毒素(TTX)、枸櫞酸緩沖液、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液均購(gòu)自Sigma公司，CSE抗體購(gòu)自Abcam公司，CBS抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。STZ冰浴避光使用枸櫞酸緩沖液配置，在溶解后5min內(nèi)使用。

2.方法

(1)動(dòng)物分組和干預(yù)措施：將16只SPF級(jí)小鼠隨機(jī)分為STZ組和對(duì)照組，每組各8只。再將10只SPF級(jí)小鼠隨機(jī)分為正常組和TTX組，每組各5只。STZ組一次性腹腔注射STZ(200 mg/kg)誘導(dǎo)1型糖尿病模型,對(duì)照組腹腔注射等體積枸櫞酸緩沖液。正常組和TTX組不做任何處理。

(2)模型建立:STZ組和對(duì)照組小鼠造模前禁食20 h后分別一次性腹腔注射STZ及枸櫞酸緩沖液。在STZ注射前當(dāng)天、后2周、后4周通過(guò)尾靜脈采血對(duì)兩組小鼠進(jìn)行空腹血糖檢測(cè)，2周后空腹血糖水平穩(wěn)定且高于16.7 mmol/L的小鼠被認(rèn)為造模成功且最終納入本研究。在STZ注射后第2周和第4周分別記錄兩組小鼠24 h排便粒數(shù)。在STZ注射后第4周，采用10%水合氯醛麻醉處死所有小鼠。

(3)免疫熒光和蛋白免疫印跡法(Western blot)：一抗、二抗孵育后，用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，在光子顯微鏡下觀察STZ組和對(duì)照組小鼠CBS和CSE在結(jié)腸全層的分布。提取結(jié)腸組織總蛋白后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后孵育一抗、二抗，后進(jìn)行顯影、曝光。以灰度分析軟件處理數(shù)據(jù)，記錄CBS和CSE的表達(dá)水平。

(4)恒溫肌槽實(shí)驗(yàn):麻醉處死所有小鼠后迅速取出結(jié)腸組織置于氧飽和的4 ℃臺(tái)式液中，分別沿腸管縱軸及橫軸方向制備縱行肌條(LMS)和環(huán)形肌條(CMS),寬約3 mm,長(zhǎng)約10 mm。將肌條連接至張力換能器(型號(hào)RM6240BD，購(gòu)自成都儀器廠)并傳導(dǎo)信號(hào)至多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(型號(hào)RM6240BD，購(gòu)自成都儀器廠)，記錄STZ組和對(duì)照組小鼠結(jié)腸平滑肌條收縮振幅。正常組小鼠肌條不做任何預(yù)處理，TTX組在浴槽中加入TTX(1μmol/L)孵育10min，之后每隔3min以濃度累計(jì)方式向兩組肌條中依次加入0.02 mmol/L、0.10 mmol/L、0.50 mmol/L和1.50 mmol/L NaHS。記錄各時(shí)段正常組和TTX組小鼠結(jié)腸平滑肌條收縮振幅，將加入0.02 mmol/L NaHS前測(cè)得的值定義為基線值。

(5)膜片鉗實(shí)驗(yàn):剝離正常小鼠結(jié)腸黏膜及黏膜下層，將剩余組織剪成小方塊，置于37 ℃氧飽和的細(xì)胞消化液中消化15～20 min。分次取適量組織塊置于含有氧飽和無(wú)鈣PSS的EP管中沖洗4次，然后置于4 ℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)前用拋光的玻璃巴氏吸管制備細(xì)胞懸液，然后將其滴入浴槽中,待細(xì)胞貼壁后，用氧飽和臺(tái)式液灌流(1 ml/min)10 min以清除細(xì)胞殘?jiān)＠萍舛巳胍弘娮铻?～7 MΩ的微電極(型號(hào)P-97,購(gòu)自Sutter公司)，在倒置顯微鏡下選擇折光性好、細(xì)胞膜光滑的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行高阻封接后負(fù)壓吸引破膜，形成全細(xì)胞記錄模式。采用Axon700B放大器及pClamp10.2軟件，鉗制電位-50 mV，階躍刺激從-50 mV開(kāi)始，以每10 mV階躍去極化至+40 mV，持續(xù)300 ms引出L型鈣通道電流，記錄曲線圖和細(xì)胞膜電容，并記錄依次加入0.10 mmol/L和0.50 mmol/L NaHS后電流曲線圖，通過(guò)計(jì)算峰電流(pA)與膜電容(pF)的比值即獲得電流密度(pA/pF)。將加入0.10 mmol/L NaHS前測(cè)得的電流密度定義為基線值。

結(jié) 果

1.兩組小鼠空腹血糖與排便粒數(shù)比較：STZ組小鼠STZ注射后第2周與第4周空腹血糖水平均顯著高于同期對(duì)照組，排便粒數(shù)均顯著低于同組注射前及同期對(duì)照組(P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠空腹血糖與排便粒數(shù)比較

2.兩組小鼠結(jié)腸平滑肌條收縮振幅比較：STZ組小鼠LMS和CMS收縮振幅均低于對(duì)照組[(0.47±0.12)g比(0.68±0.19)g，(0.25±0.07)g比(0.38±0.04)g，P<0.05]。

3.兩組小鼠CBS和CSE在中段結(jié)腸的表達(dá)情況：光鏡下可見(jiàn)，CBS主要分布在小鼠結(jié)腸的黏膜層和肌間神經(jīng)叢(圖1A、1B)，CSE主要分布在黏膜層、平滑肌細(xì)胞和肌間神經(jīng)叢(圖1C、1D)。STZ組小鼠結(jié)腸組織CBS和CSE表達(dá)水平均高于對(duì)照組[(0.61±0.16)g比(0.36±0.10)g，(0.84±0.16)g比(0.57±0.09)g，P<0.05]。

圖1 兩組小鼠CBS和CSE在中段結(jié)腸的表達(dá)情況(A、C：對(duì)照組；B、D：STZ組；A、B：CBS；C、D：CSE；DAPI染色，×200)

4.不同濃度NaHS對(duì)正常小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞L型鈣通道電流的作用比較：正常組和TTX組小鼠NaHS(0.1 mmol/L)LMS及CMS收縮振幅均高于同組基線值，兩組小鼠NaHS(1.5 mmol/L) LMS及CMS收縮振幅均低于同組基線值(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度NaHS組小鼠結(jié)腸平滑肌條收縮振幅比較

5.不同濃度NaHS組正常小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞電流密度比較：正常小鼠NaHS(0.10 mmol/L)組電流密度(-4.50±0.63)pA/pF高于NaHS(0.50 mmol/L)組(-3.03±1.12)pA/pF及基線值(-3.34±0.67)pA/pF(P<0.05)；NaHS(0.50 mmol/L)組電流密度與基線值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

討 論

糖尿病患者結(jié)腸傳輸時(shí)間延長(zhǎng)，常伴發(fā)便秘[1,10]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腸神經(jīng)系統(tǒng)、腸間質(zhì)Cajal細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞功能異常，興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡等參與糖尿病胃腸動(dòng)力障礙的發(fā)生[2]。H2S作為繼NO和CO后第3個(gè)氣體信號(hào)分子，具有多種生物學(xué)功能，包括參與消化道動(dòng)力的調(diào)控[4-6]。內(nèi)源性H2S可通過(guò)CBS和CSE催化底物L(fēng)-半胱氨酸而生成[6,13]。因此H2S合成酶表達(dá)改變會(huì)導(dǎo)致腸道H2S水平異常。STZ誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)不同組織、器官H2S水平均增加[7]，說(shuō)明STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型存在H2S水平異常。本研究發(fā)現(xiàn)，STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠排便減少、結(jié)腸動(dòng)力減慢，可能與腸道組織H2S合成增加，抑制平滑肌細(xì)胞L型鈣通道開(kāi)放有關(guān)。

STZ誘導(dǎo)糖尿病是經(jīng)典且有效的造模方法，在前期很多研究中均采用[7-9]。本研究首先觀察了模型組小鼠的排便情況，結(jié)果顯示STZ組小鼠排便粒數(shù)在STZ誘導(dǎo)后第2周和第4周均顯著下降，并明顯低于同期對(duì)照組，間接說(shuō)明糖尿病模型小鼠結(jié)腸蠕動(dòng)減慢。我們還觀察了小鼠結(jié)腸LMS和CMS自發(fā)性收縮振幅改變，結(jié)果顯示STZ組小鼠LMS和CMS收縮振幅均較對(duì)照組明顯減弱。上述結(jié)果說(shuō)明STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠存在結(jié)腸動(dòng)力減弱，與前期研究結(jié)果一致[12]。研究已證實(shí)STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠結(jié)腸傳輸時(shí)間延長(zhǎng)[9]，而排便粒數(shù)作為反映結(jié)腸傳輸功能的間接指標(biāo)，在本研究中已證實(shí)STZ組顯著低于對(duì)照組。因此，本研究未進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)腸傳輸時(shí)間以評(píng)估糖尿病模型小鼠結(jié)腸動(dòng)力。

本研究結(jié)果顯示，CBS主要分布在小鼠中段結(jié)腸的黏膜層和肌間神經(jīng)叢，而CSE主要分布在黏膜層、平滑肌細(xì)胞和肌間神經(jīng)叢。一方面說(shuō)明黏膜及神經(jīng)源性的H2S來(lái)自CBS和CSE，而平滑肌源性的H2S主要來(lái)自CSE催化底物生成。另一方面，說(shuō)明H2S對(duì)腸道動(dòng)力的調(diào)控可能為多靶點(diǎn)。但我們前期另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示CBS在大鼠近端結(jié)腸平滑肌層表達(dá)[8]。該差異可能與種屬和檢測(cè)方法不同有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，糖尿病模型小鼠結(jié)腸CBS和CSE表達(dá)水平明顯增加，說(shuō)明糖尿病模型小鼠腸道內(nèi)源性H2S合成增加。

為明確H2S對(duì)小鼠結(jié)腸動(dòng)力的作用，本研究觀察不同濃度NaHS對(duì)小鼠結(jié)腸組織LMS和CMS自發(fā)性收縮振幅的影響。與NaHS對(duì)小鼠胃竇平滑肌的收縮作用一致[6]，本研究也發(fā)現(xiàn)NaHS對(duì)小鼠結(jié)腸動(dòng)力可能具有雙向調(diào)節(jié)作用，低濃度NaHS(0.1 mmol/L)促進(jìn)LMS和CMS收縮，而高濃度NaHS(0.5～1.5 mmol/L)可明顯抑制LMS和CMS收縮。為進(jìn)一步明確NaHS對(duì)結(jié)腸平滑肌收縮的雙向作用是神經(jīng)源性還是肌源性，本研究采用TTX孵育LMS和CMS以阻斷腸神經(jīng)纖維電壓依賴鈉離子通道，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTX孵育不能阻斷NaHS對(duì)小鼠結(jié)腸平滑肌收縮的雙向調(diào)節(jié)作用，說(shuō)明H2S對(duì)結(jié)腸平滑肌收縮的雙向作用是肌源性的。為進(jìn)一步明確H2S對(duì)結(jié)腸動(dòng)力雙向調(diào)節(jié)作用的潛在機(jī)制，本研究觀察了不同濃度NaHS對(duì)正常小鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞L型鈣通道電流的影響。L型鈣通道是調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞收縮和舒張的重要離子通道[12]。鈣通道開(kāi)放使鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞膜去極化，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞收縮。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaHS(0.1 mmol/L)使峰電流增加，但不會(huì)影響鈣通道的電壓依賴特性；而NaHS(0.5 mmol/L)使峰電流密度減低，峰電位右移，說(shuō)明低濃度NaHS促進(jìn)L型鈣通道開(kāi)放從而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞收縮，而高濃度NaHS抑制鈣通道開(kāi)放進(jìn)而抑制平滑肌細(xì)胞收縮。結(jié)合NaHS對(duì)小鼠結(jié)腸平滑肌條自發(fā)性收縮活動(dòng)的雙向調(diào)節(jié)作用，本研究認(rèn)為L(zhǎng)型通道參與NaHS對(duì)小鼠結(jié)腸收縮的雙重調(diào)節(jié)作用。

相關(guān)研究報(bào)道，NaHS生成H2S濃度約為NaHS濃度的1/3，故本研究中NaHS產(chǎn)生的H2S濃度為33～165 μmol/L,接近哺乳動(dòng)物組織中H2S的生理濃度(1～160μmmol/L)[13-14]。因此，本研究推測(cè)正常小鼠腸道H2S對(duì)平滑肌細(xì)胞具有促進(jìn)作用，從而促進(jìn)結(jié)腸蠕動(dòng)；而糖尿病模型小鼠由于腸道H2S合成酶表達(dá)增加，導(dǎo)致內(nèi)源性H2S生成增加，而高濃度的H2S反向抑制L型鈣通道開(kāi)放，從而抑制結(jié)腸收縮，導(dǎo)致糖尿病模型小鼠結(jié)腸慢傳輸。但是本研究并未對(duì)糖尿病模型小鼠腸道產(chǎn)H2S的相關(guān)菌群進(jìn)行檢測(cè)，因此腸道菌群失衡是否導(dǎo)致內(nèi)源性H2S生成增加需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠結(jié)腸傳輸減慢，可能與結(jié)腸內(nèi)源性H2S生成增加，進(jìn)而抑制結(jié)腸平滑肌細(xì)胞L型鈣通道開(kāi)放有關(guān)。因此，抑制內(nèi)源性H2S生成可能有助于改善糖尿病患者慢性便秘。