張璐，張土金

1.南昌市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 南昌 330000；2.上高縣婦幼保健院，江西 上高 336400

補(bǔ)益經(jīng)典中藥方生脈飲（黨參方），為《醫(yī)學(xué)啟源》［1］中的古方生脈散的衍生配方，由麥冬、黨參、五味子組成。品種收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十冊(cè)［2］。具有益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津的功效，被廣泛用于心肌保護(hù)，心功能改善等方面的治療。

生脈飲（黨參方）制法中規(guī)定的矯味劑為單糖漿，單糖漿為蔗糖的近飽和水溶液，每1 000 mL 中含蔗糖850 g［3］。藥用輔料蔗糖在制劑中主要發(fā)揮甜味劑或矯味劑的作用，廣泛用于口服制劑中，是液體制劑（如糖漿劑、合劑）的主要成分［4］?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中雖然對(duì)控制蔗糖添加量設(shè)置了相對(duì)密度檢查項(xiàng)，但該方法缺乏專屬性，無法準(zhǔn)確體現(xiàn)樣品中蔗糖的真實(shí)使用情況，不排除某些不法企業(yè)違反生產(chǎn)工藝規(guī)定，在蔗糖中摻雜其他糖類物質(zhì)，以達(dá)到降低成本的目的。

目前，在藥品、食品中檢測(cè)糖類成分的分析方法較多，如HPLC-ELSD 法、HPLC-RID 法、HPLC-CAD 法、HPLC-FLD 法、UPC2-MS 法、拉曼光譜法、近紅外光譜法等［5-12］，其中HPLC-RID法以通用性好、靈敏度高成為目前糖類成分檢測(cè)的主要方法。本實(shí)驗(yàn)通過系統(tǒng)研究構(gòu)建了HPLC-RID測(cè)定果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的檢測(cè)方法，對(duì)生脈飲（黨參方）是否存在利用其他糖類物質(zhì)代替蔗糖進(jìn)行投料的情況進(jìn)行定向篩查。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀（安捷倫公司），配置RID 檢測(cè)器；MettlerToledo XS105DU 電子天平、ME204E 電子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-300DE 數(shù)控超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

果糖（CNW 4.460070.0005，上海安譜科技股份有限公司，含量100%）；蔗糖（BW5011，壇墨質(zhì)檢技股份有限公司，含量99.9%）；葡萄糖（110833-201908，含量99.8%）；麥芽糖（100287-201905，含量94.4%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純（購(gòu)于賽默飛公司）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

14 批生脈飲（黨參方）樣品來自2 個(gè)生產(chǎn)廠家。企業(yè)1：批號(hào)20190501、20190214、20190628、20191123、20191018、20191015、20190808、20190306、20191018、20 190906；企 業(yè)2：批 號(hào)19072201、20012001、20040602、19 062101；以 上規(guī)格均為10 mL/支。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent 5TC-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（70∶30）；柱溫：45 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；示差折光檢測(cè)池溫度：40 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取適量果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對(duì)照品，用水制備成濃度分別為2.452、4.503、2.042、3.524 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取混勻后的供試品1 g 于50 mL 量瓶中，加水約40 mL，超聲處理10 min，放至室溫，加水至刻度，搖勻，用0.45 μm 濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液 按照生脈飲（黨參方）處方中各藥比例制備缺單糖漿的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制得陰性供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及缺單糖漿的陰性供試品溶液按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果如圖1 所示，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等4 種成分色譜峰分離良好，分離度均大于1.5；陰性樣品中未見其他成分色譜峰對(duì)4 種成分產(chǎn)生干擾，表明該分析方法專屬性良好，適用于果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的定向篩查。

圖1 高效液相色譜圖：A.陰性供試品；B.混合對(duì)照品；C.供試品（批號(hào)：20190906）；D.供試品（批號(hào)：20190501）

2.4 線性關(guān)系與檢測(cè)限考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL 于5 mL 量瓶中，用水稀釋，制備6 個(gè)濃度的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)（X）為對(duì)照品的濃度（mg/mL），縱坐標(biāo)（Y）為峰面積。取“2.2.1”中混合對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，檢測(cè)限為3 倍信噪比。果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，4 種成分分別在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法適用于不同濃度水平的替代糖漿的定量測(cè)定。

表1 4種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖成分峰面積的RSD 依次為1.07%、1.58%、2.42%、2.15%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)20190628），室溫下放置，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 取樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品中檢出果糖，蔗糖，麥芽糖，RSD 依次為2.86%、2.58%、2.16%，表明該供試品溶液在24 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

另取供試品溶液（批號(hào)20190501），室溫下放置，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 取樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品中檢出果糖，葡萄糖，麥芽糖，RSD 依次為2.37%、1.96%、2.03%，表明該供試品溶液在24 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批生脈飲（黨參方）（批號(hào)20190628）樣品，按“2.2.3”項(xiàng)方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果供試品中果糖，蔗糖，麥芽糖的RSD 分別為1.15%、2.78%、2.81%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

另取生脈飲（黨參方）（批號(hào)20190501）樣品，按“2.2.3”項(xiàng)方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果供試品中果糖，葡萄糖，麥芽糖的RSD 分別為1.87%、2.64%、1.91%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的生脈飲（黨參方）（批號(hào)20190628）9 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置50 mL 量瓶中。分別按低、中、高3 種濃度水平精密加入果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖對(duì)照品（每個(gè)濃度各3 份），分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行品測(cè)定，每批樣品平行測(cè)定2 次，取平均值，依據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算各成分的加樣回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度，可用于生脈飲（黨參方）中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的測(cè)定。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定

取14 批生脈飲（黨參方）樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行樣品測(cè)定，計(jì)算14 批次樣品中4 種成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 14批生脈飲（黨參方）樣品中4種成分的含量測(cè)定結(jié)果（n=2） mg/g

3 討論

3.1 方法適用性考察

本實(shí)驗(yàn)考察了不同色譜柱［Thermo ScientificTMCarbopacTMPA100（250 mm×2.0 mm，5 μm），Agilent 5TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Aminex HPX-87C（250 mm×4.0 mm，5 μm）］；流動(dòng)相中水溶液的比例（35%、30%、25%、20%）；不同的色譜柱溫度（35 ℃、40 ℃、45 ℃）；不同流速（0.6、0.8、1.0 mL/min）對(duì)4 種成分分離效果的影響。當(dāng)測(cè)定條件發(fā)生小幅度變化時(shí)，測(cè)定結(jié)果未發(fā)生顯著變化，說明該方法耐用性良好。采用Agilent 5TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為45 ℃，流動(dòng)相水溶液比例為30%，流速為1.0 mL/min 時(shí)，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖分離效果最好。

3.2 結(jié)果分析

對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后可知，企業(yè)2 的樣品中檢出果糖、葡萄糖、蔗糖，均未檢出麥芽糖。蔗糖是經(jīng)一分子葡萄糖與一分子果糖的半縮醛羥基彼此縮合失水而形成的二糖，其在酸性條件下遇熱分解為葡萄糖和果糖（1∶1）［13］。企業(yè)2 所有樣品中葡萄糖和果糖含量均大致相當(dāng)，但經(jīng)折算后可知，樣品批間的蔗糖含量并不穩(wěn)定，說明該企業(yè)對(duì)生產(chǎn)工藝控制不嚴(yán)。

企業(yè)1 的產(chǎn)品中有5 批樣品檢出了麥芽糖；有7 批樣品檢出葡萄糖，其中有3 批樣品的葡萄糖含量為100%。說明該企業(yè)未遵守產(chǎn)品批準(zhǔn)的生產(chǎn)工藝，添加麥芽糖、葡萄糖進(jìn)行投料生產(chǎn)。且兩個(gè)企業(yè)14 批樣品經(jīng)折算均遠(yuǎn)超其處方量23 mg/g 蔗糖的正常值，產(chǎn)品質(zhì)量存在較大的安全風(fēng)險(xiǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-RID 法對(duì)生脈飲（黨參方）中4 種糖類成分進(jìn)行分析，可真實(shí)反映生脈飲（黨參方）中是否存在利用其他糖類物質(zhì)替代蔗糖進(jìn)行投料的情況。該方法具有簡(jiǎn)單快速、高效、準(zhǔn)確、無干擾的優(yōu)勢(shì)，不僅為生脈飲（黨參方）質(zhì)量控制提供了有效的方法，同時(shí)也為其安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了科學(xué)的依據(jù)。